耐低溫纖維素降解復合菌系的篩選

顏淑慧，孟慶俊*，許 瑞，李晟楠，王立艷，焦 揚，宋 超

1. 中國礦業大學環境與測繪學院，江蘇 徐州 221116

2. 扎賚諾爾煤業有限責任公司，內蒙古 滿洲里 021400

農業廢棄秸稈和牛羊糞是目前常用的生物質肥料[1]，廣泛應用于土壤有機質含量的提升. 這些生物材料含有大量的纖維素，自然條件下降解時間長、難度高，不利于快速提升土壤肥力[2]；而且在北方高寒地區低溫持續時間長，造成堆肥反應啟動困難、堆肥周期長、效率低[3]，纖維素類物質未能得到及時有效的利用，導致病蟲害加劇，影響下一年作物生長，對農業生產帶來嚴重弊端.

目前對纖維素類物質的處理方法主要有物理、化學和生物降解法[2]. 微生物作為驅動秸稈等生物質轉化的內在動力，通過能夠產生纖維素降解酶的細菌、真菌、放線菌等微生物對纖維素類物質進行降解，同時具有溫和、污染小、成本低和環境友好的特點[4]，因而微生物降解技術具有廣泛的應用前景. 許多學者通過分離、純化篩選出單株纖維素降解菌. 例如：Khosravi等[5]從土壤和樹葉樣本中分離、純化出一株纖維素降解細菌，屬于短芽孢桿菌；李子婧等[6]從竹屑、枯枝爛葉、羊糞等廢棄物中篩選出一株高效纖維素降解真菌，菌種鑒定為長枝木霉菌. 分離、純化所得的單菌株雖具有高效的纖維素降解能力，但是分泌的纖維素降解酶種類和產酶量有限，故單菌株的篩選僅為纖維素類物質資源化利用提供了良好的菌種資源[7]. 纖維素類物質的降解往往需要多種微生物共同協作完成. 因此，篩選低溫條件下高效降解纖維素復合菌系的研究和應用已成為當前的研究熱點. 隨著對纖維素降解菌研究的不斷深入，如何使實驗室理論研究更加貼合實際生產，從而走向生產開發實踐是當前研究的難點[8].

從自然環境中直接篩選或者組配高效纖維素降解復合菌群是目前提高纖維素類物質降解效率的有效途徑之一. 如黃青盈等[2]從食堂餐廚垃圾、廢水及被廢水污染的土壤中篩選出11株具有秸稈降解能力的菌株，經過7 d的發酵降解，單一菌株最高秸稈降解率為21.64%，多種菌株混合處理秸稈的降解率可達23.86%. 張鑫等[9]從多年秸稈還田土壤、牛羊糞、森林腐殖質中以玉米秸稈為碳源通過富集和溫度梯度馴化獲得的3個玉米秸稈低溫高效降解復合菌系，15 ℃培養20 d后玉米秸稈降解率分別為35.33%、33.34%和31.33%. 通過長期的限制性繼代培養達到富集具有降解纖維素能力的微生物菌群，相對于以羧甲基纖維素鈉為底物而言，直接以玉米秸稈作為唯一碳源進行富集培養，能更真實地模擬纖維素類物質的降解情況，更可靠地鑒定纖維素降解菌系的作用效果. 通過溫度梯度馴化培養技術，使微生物對溫度這一環境因子的耐受范圍做出調整，逐漸產生一個新的最適生存范圍[10]. 因此，該文以5 ℃作為溫度梯度對適應培養基條件的微生物進行多層次遞進式篩選，使適應培養基條件的微生物盡可能多地在低溫條件下生存，通過多種微生物之間協作共同提高降解纖維素類物質的能力.

目前通過技術手段篩選馴化出的低溫纖維素降解菌既有嗜冷菌(Psychrophiles)又有耐冷菌(Psychrotrophys)，最適生長溫度為10～25 ℃[11]. 一般情況下秸稈還田時間為10—11月或6—7月，北方高寒地區夏季平均溫度15 ℃. 該文基于已有研究，以北方高寒草原地區礦區土壤中的土著微生物以及對纖維素具有較好降解作用的枯草芽孢桿菌[12]、細黃鏈霉菌[13]、哈茨木霉菌[14]作為菌源材料，以玉米秸稈作為碳源進行富集培養和溫度梯度馴化，篩選出耐15 ℃低溫條件下高效降解纖維素的復合菌系，旨在提高纖維素類物質利用效率，保護農田耕地質量，助力農業可持續發展.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌源與秸稈樣品

枯草芽孢桿菌、細黃鏈霉菌、哈茨木霉菌購于山東綠隴生物科技有限公司，另取內蒙古草原地區礦區土壤作為土著微生物菌源.

該文以玉米秸稈中的纖維素類物質作為纖維素降解菌的限制性碳源和降解對象，挑選粗細、大小適中的玉米秸稈，用流水沖洗干凈，在65 ℃的烘箱中烘至恒質量，烘干后的玉米秸稈再剪成2～3 cm的小段，滅菌備用.

1.1.2 培養基

篩選培養基(赫奇遜培養基)[15]：KH2PO41.0 g、NaCl 0.1 g、MgSO4·7H2O 0.3 g、NaNO32.5 g、CaCl20.1 g、FeCl30.01 g、蒸餾水1 000 mL.

產酶培養基[9]：蛋白胨0.5 g、(NH4)2SO42 g、K2HPO41 g、尿素0.6 g、MgSO4·7H2O 0.05 g、MnSO4·7H2O 0.016 g、ZnSO4·7H2O 0.017 g、CaCl20.02 g、NaCl 0.2 g、蒸餾水1 000 mL.

各培養基皆于250 mL錐形瓶中加入90 mL培養液和1.0 g玉米秸稈，121 ℃滅菌20 min，備用.

1.2 試驗方案

1.2.1 復合菌系的來源與馴化

1.2.1.1 菌源富集培養

將礦區土壤、3種纖維素降解菌劑、礦區土壤添加3種纖維素降解菌劑依次作為SL、MM、MS處理組，每個處理組設3個重復. 取各處理組10 g于90 mL蒸餾水中振蕩15 min[16]，記為菌源SL0、MM0、MS0. 靜置10 min后，各取10 mL懸濁液分別接種于90 mL的赫奇遜培養基中，于35 ℃恒溫培養箱中培養. 當秸稈出現腐解現象(7 d)時進行轉接，如此轉接2次[9]. 通過富集培養獲得具有纖維素降解能力的微生物.

1.2.1.2 溫度梯度馴化

取上述富集培養后的培養液各10 mL分別接種于90 mL赫奇遜培養基中，于35 ℃恒溫培養箱中培養. 當秸稈降解表現穩定時(15 d)進行轉接，每轉接一次溫度降低5 ℃，同時取出玉米秸稈測其降解率，直至降至15 ℃[9]. 15℃下培養至第15、30天分別測定玉米秸稈降解率，即為經過富集培養和溫度梯度馴化過程所得的馴化后玉米秸稈的降解率. SL、MM、MS處理組通過溫度梯度馴化獲得耐15 ℃低溫的纖維素降解復合菌系，分別記為SL15、MM15、MS15.

取各菌源SL0、MM0、MS0懸濁液10 mL分別接種于90 mL赫奇遜培養基中，15 ℃下培養，15 d后測定玉米秸稈的降解率，即為未經富集培養和溫度梯度馴化過程所得的未馴化時玉米秸稈降解率. 通過比較馴化篩選前后玉米秸稈中纖維素類物質的降解率，闡明經馴化篩選獲得的復合菌系在低溫條件下的纖維素降解能力.

1.2.2 粗酶液制備

取SL15、MM15、MS15培養液各10 mL分別接種于90 mL產酶培養基中，于15 ℃下培養，在第3、6、9、12、15、18、21、24、27、30天時取各復合菌系發酵液2 mL，于4 ℃、5 000 r/min下離心10 min，上清液即為粗酶液，用于酶活性的測定[17].

1.2.3 微生物組成多樣性分析

取菌源SL0、MM0、MS0以及馴化篩選獲得的復合菌系SL15、MM15、MS15各5 mL，4 ℃、5 000 r/min下離心10 min，棄上清液，取沉淀，反復多次確保已完全沉淀，由上海美吉生物醫藥科技有限公司進行16S rRNA基因測序，細菌PCR引物為338F(5'-ACTCCTACGG GAGGCAGCAG-3')、806R(5'-GGACTACHVGGG TWTCTAAT-3')，真菌PCR引物為ITS1(5'-CTTG GTCATTTAGAGGAAGTAA-3')、ITS2(5'-GCTG CGTTCTTCATCGATGC-3').

1.3 測試方法

1.3.1 玉米秸稈降解率的測定

將玉米秸稈用水洗凈，于65 ℃烘箱中烘干至恒質量，采用式(1)[9]計算玉米秸稈降解率.

式中：W為玉米秸稈降解率，%；W0為接種前培養基中的玉米秸稈質量，g；W1為培養結束烘干后降解剩余的玉米秸稈質量，g.

1.3.2 酶活性的測定

1.3.2.1 濾紙酶活性測定

取粗酶液0.2 mL置于25 mL具塞刻度試管中，加入pH=4.8的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液1.8 mL，以1 cm×6 cm的濾紙條作為酶解底物，50 ℃下水浴60 min. 加入3,5二硝基水楊酸(DNS)試劑3 mL，在沸水浴10 min后可與還原糖反應生成棕紅色物質，還原糖的量與棕紅色物質顏色深淺成一定的比例關系.冷水沖試管，使反應液迅速冷卻至室溫，定容至25 mL，于540 nm處測定吸光值. 酶活性空白對照組將粗酶液在100 ℃下進行煮沸處理，使其失活后進行濾紙酶活性測定[18].

1.3.2.2 內切酶活性測定

取粗酶液0.2 mL置于25 mL具塞刻度試管中，加入羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)緩沖液1.8 mL，50 ℃下水浴30 min后，加入DNS顯色液3 mL以終止反應. 沸水浴10 min后，冷水沖試管，使反應液迅速冷卻至室溫，定容至25 mL，于540 nm處測定吸光值[2].酶活性空白對照組處理同1.3.2.1節.

酶活性單位(U/mL)定義為1 mL粗酶液在1 min內催化底物水解生成1 μmol葡萄糖所需的酶量[2].

酶活性計算公式[18]：

式中：X為酶活性，U/mL；m為反應過程中產生葡萄糖的含量，mg/mL；n為粗酶液稀釋倍數；V為反應體系中粗酶液的體積，mL；T為反應時間，min.

1.4 數據處理

試驗數據均為3次重復試驗結果的平均值，采用Excel 2021軟件進行數據整理；采用Origin 2019b軟件進行制圖；運用SPSS 27.0軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，結合鄧肯(Duncan)氏法進行差異顯著性檢驗；采用美吉生物云平臺(https://cloud.majorbio.com)進行微生物群落結構繪圖.

2 結果與分析

2.1 耐低溫纖維素降解復合菌系的篩選

由圖1可見，在溫度梯度馴化過程中各處理組從25 ℃降到15 ℃過程中玉米秸稈中纖維素類物質降解率趨于平穩，低溫(15 ℃)條件下馴化后復合菌系的纖維素類物質降解效果能夠達到高溫(35 ℃)狀態下的降解效果.

圖1 不同溫度下各處理組玉米秸稈的降解率Fig.1 Degradation rate of maize straw in different treatment groups under different temperature

從圖2可以看出，在15 ℃下，未馴化的SL處理組對纖維素類物質的降解率僅為10.54%，說明土壤中存在的耐15 ℃纖維素降解菌數量較少，自然條件下對玉米秸稈中纖維素類物質的降解能力較低. 含有纖維素降解菌劑的MM和MS處理組在未經馴化時對纖維素類物質的降解率僅分別為16.60%、17.42%.各處理組經馴化篩選后纖維素類物質降解率皆顯著高于未馴化時的降解率. 由此可見，溫度梯度馴化對于低溫條件下纖維素類物質的降解具有重要意義，獲得的復合菌系大大提高了纖維素類物質的降解率.

圖2 15 ℃時不同處理條件下各處理組玉米秸稈降解率Fig.2 Degradation rate of maize straw in different treatment groups at 15 ℃

結合圖1和圖2分析發現，以土著微生物添加纖維素降解菌劑進行生物加強的MS處理組經篩選后具有最高的降解能力，說明將具有特定功能的微生物菌劑添加到土著微生物中，在增強纖維素降解能力的同時還可以活化土著微生物的降解能力[19]，因此其纖維素降解能力顯著高于土著微生物和纖維素降解菌劑的單獨作用. 同時隨著培養時間延長，降解率逐漸增加，說明復合菌系內纖維素降解酶持續發揮作用，具有長期高效降解纖維素類物質的能力. 馴化篩選后的SL、MM和MS處理組培養至第15天時，纖維素類物質降解率分別為22.33%、26.33%和29.23%. 經過馴化篩選得到的3種耐低溫纖維素降解菌與目前相關報道[2,9]的纖維素降解菌的降解能力相近，因此其具有一定的應用前景.

2.2 溫度梯度馴化后復合菌系酶活性動態分析

根據纖維素酶的結構特性和各組分功能將其分為3類，分別為外切葡聚糖酶、內切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶，其協同作用可以將纖維素分解成葡萄糖等單糖[21]. 內切葡聚糖酶通常用來表征纖維素樣品的糖化能力，是纖維素降解過程中的酶活性[2]. 濾紙酶活性能夠較真實地反映天然纖維素的情況[22]，以及3類纖維素酶組分協同水解纖維素的能力[23]. 故該文以濾紙酶活性、內切酶活性來表征復合菌系的纖維素降解能力.

2.2.1 溫度梯度馴化后復合菌系濾紙酶活性特征

經溫度梯度馴化后獲得的纖維素降解復合菌系SL15、MM15、MS15的濾紙酶活性結果如圖3所示. 隨著培養時間的延長，復合菌系濾紙酶活性普遍先升高后緩慢降低. 自第15天后，濾紙酶活性基本達到峰值并保持穩定，此時復合菌系對纖維素的降解開始穩定. 因此在溫度梯度馴化過程中，在第15天可以觀察到培養基顏色變深、玉米秸稈發生軟化、出現碎屑狀，進而進行轉接培養. 發酵培養后期由于營養物質不足導致部分微生物機體降低或停止細胞物質合成，生化反應能力降低，因此濾紙酶活性略有下降. 在發酵培養前期(0～9 d)，復合菌系SL15和MS15的酶活性較MM15增長緩慢，推測原因可能為SL15和MS15中包含土壤中某些不具有纖維素降解能力的微生物，只是適應篩選培養基的條件而被保留，在發酵培養前期要適應產酶培養基的營養環境條件，因此酶活性增長較為緩慢.

圖3 復合菌系濾紙酶活性動態變化Fig.3 Dynamic change of filter paper enzyme activity of complex bacteria

復合菌系SL15、MM15和MS15的濾紙酶活性最高分別為4.031 2、4.459 1和4.692 5 U/mL. 在發酵培養后期MS15濾紙酶活性顯著高于SL15、MM15，說明在土著微生物中加入微生物菌劑會加速纖維素類物質的降解，更快達到腐熟的條件，縮短堆肥發酵進程[24].

2.2.2 溫度梯度馴化后復合菌系內切酶活性特征

各復合菌系內切酶活性如圖4所示. 在發酵產酶的30 d內各復合菌系內切酶活性變化規律一致，酶活性在(1.908 9±0.317 8) U/mL范圍內波動. 各復合菌系SL15、MM15和MS15內切酶活性在第18天達到峰值，分別為2.019 1、2.109 9和2.226 7 U/mL，MS15內切酶活性顯著高于SL15、MM15. 在植物組織中，木質素、纖維素和半纖維素以共價鍵形式結合，將纖維素分子包裹于其中形成堅固的天然壁壘，一般微生物難以進入其中分解纖維素[25]. 在降解前期木質素降解微生物發揮作用，破壞了纖維素分子的天然壁壘，使纖維素降解微生物進一步發揮作用，因此降解過程中內切酶活性于第18天出現峰值.

圖4 復合菌系內切酶活性動態變化Fig.4 Dynamic change of endoglucanase activity of complex bacteria

微生物體內的生化反應能夠在低溫下高效進行是微生物能夠在低溫生存的前提. 隨著發酵時間產生波動的酶活性表明，在15 ℃下，經富集和溫度梯度馴化后的復合菌系中微生物仍然能夠發揮正常的生化作用，參與纖維素降解的酶仍具有高效的酶活性，生產和保存適當的新陳代謝產物[26].

2.3 微生物群落多樣性和群落結構組成差異性分析

通過玉米秸稈中纖維素類物質的降解率以及濾紙酶活性、內切酶活性的變化可知，篩選所得的耐低溫降解復合菌系具有較強的纖維素降解能力. 為了進一步明確各復合菌系的優勢菌種和復合菌系相對于菌源微生物群落結構的變化，表明富集培養和溫度梯度馴化對菌源微生物的影響，需對菌源SL0、MM0、MS0和復合菌系SL15、MM15、MS15，進行細菌和真菌微生物群落結構組成多樣性分析.

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2.3.1 菌源微生物群落多樣性和群落結構組成差異性分析

由菌源SL0、MM0、MS0的微生物多樣性分析(見圖5)發現，在門水平上菌源SL0微生物組成復雜，主要包括變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteriota)、擬桿菌門(Bacteroidota)以及子囊菌門(Ascomycota)，且放線菌門和子囊菌門為優勢菌. 菌源MM0主要由變形菌門、厚壁菌門(Firmicutes)、子囊菌門組成. 菌源MS0結合了SL0和MM0的優勢菌，放線菌門相對豐度明顯增加，而變形菌門的相對豐度有所減少，且出現了菌源SL0中的少量真菌.

圖5 門分類水平上菌源中細菌及真菌的群落組成Fig.5 Community composition of bacteria and fungi in the bacterial source at the phylum classification level

進一步在屬水平上進行Venn圖(見圖6)分析，統計樣本中所共有的和獨有的菌屬數目. 菌源SL0來自土壤，土壤中微生物種類繁多，與菌源MM0、MS0相比微生物多樣性更豐富.

圖6 不同菌源中細菌及真菌物種Venn圖Fig.6 Venn chart of bacteria and fungi species in different bacterial sources

2.3.2 復合菌系細菌微生物群落多樣性和群落結構組成差異性分析

基于門分類水平上(others相對豐度＜1%)的分析(見圖7)表明，各復合菌系的細菌群落主要隸屬3個門，分別為變形菌門、擬桿菌門和厚壁菌門，與國內外經多年研究[27-29]已知的具有纖維素分解功能細菌門類一致. 其中變形菌門是SL15復合菌系中最豐富的細菌類群，相對豐度為82.57%. 擬桿菌門在菌源MM0、MS0中相對豐度極小，而經過溫度梯度馴化篩選后成為MM15和MS15復合菌系中最豐富的細菌類群，相對豐度分別為48.92%和50.46%，在SL15中為12.02%. 可見擬桿菌門不僅適應培養基的條件而且在低溫條件下仍具有較強的纖維素降解能力. 放線菌門在菌源MS0、SL0中作為優勢菌存在，在菌源MM0中也占有一定的比例，而經過溫度梯度馴化后各復合菌系中放線菌門的相對豐度僅為2%左右，推測其原因為放線菌的繁殖速度較細菌緩慢，降解能力不如真菌，盡管具有較強的抗環境脅迫能力，但是在有限的營養和空間條件下，具有特定纖維素降解能力的細菌、真菌同樣適應培養基條件，因此細菌、真菌大量繁殖影響了放線菌的生長狀態，抑制了其產酶能力.

圖7 門分類水平上復合菌系細菌的群落組成Fig.7 The community composition of complex bacteria at phylum level

復合菌系在屬水平上(others相對豐度＜5%)的細菌微生物群落組成見圖8. MM15細菌群落組成主要包括金黃桿菌屬(Chryseobacterium，占34.79%)、克呂沃爾氏菌屬(Kluyvera，占15.48%)和鞘氨醇桿菌屬(Sphingobacterium，占13.32%). MS15中優勢菌屬主要有鞘氨醇桿菌屬(占47.75%)和布魯氏菌屬(Brucella，占17.79%). SL15細菌群落結構中相對豐度較大的是假單胞菌屬(Pseudomonas，占25.03%)、鞘氨醇桿菌屬(占9.15%)和交替紅色桿菌屬(Altererythrobacter，占8.14%). 鞘氨醇桿菌在3種復合菌系中皆為優勢菌屬，其原因為鞘氨醇桿菌營養來源比較寬廣，代謝類型復雜多樣，適應能力極強；對生存環境溫度沒有太大的需求，能在5～42 ℃的溫度范圍內生長[30]，因此能很快適應溫度梯度的變化，廣泛分布于復合菌系中. 鞘氨醇桿菌在復合菌系MS15中相對豐度最高，研究[31-32]表明，鞘氨醇桿菌不僅能夠分泌纖維素酶等直接對纖維素類物質進行降解，還可以利用乙酸、乳酸等中間產物調節發酵體系酸堿度維持中性水平來協調降解秸稈，并具有抵抗極端環境的能力，故馴化篩選過程中MS處理組玉米秸稈中纖維素類物質降解率以及復合菌系MS15的濾紙酶活性和內切酶活性顯著高于其余兩組.

圖8 屬分類水平上復合菌系細菌的群落組成Fig.8 The community composition of complex bacteria at genus level

進一步在屬水平上進行Venn圖(見圖9)分析，發現有29個屬為3個復合菌系所共有，稱為核心微生物(見圖10)，包括鞘氨醇桿菌屬、金黃桿菌屬、布魯氏菌屬、假單胞菌屬、類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)以及無色桿菌屬(Achromobacter)等，來自菌源中的變形桿門、厚壁菌門、擬桿菌門. 在各復合菌系中放線菌門相對豐度僅為2%左右，可能出現在共有菌屬中或者獨有菌屬中. 盡管放線菌門相對豐度低，但在對其他降解菌株生長環境起到的調節作用以及與其他菌株存在潛在的協同作用等方面不容忽視.

圖9 復合菌系細菌物種Venn圖Fig.9 Venn chart of complex bacteria

圖10 復合菌系細菌共有屬Fig.10 Complex bacteria of bacteria common genus

與菌源相比，經篩選后的SL15、MS15復合菌系中細菌多樣性有所減少，說明部分微生物在溫度梯度馴化篩選過程中淘汰了與玉米秸稈降解無關或不適應培養基條件的菌屬，同時也富集了耐低溫的纖維素降解菌. 經馴化篩選后MM15的細菌菌屬數量并無減少，推測其原因是，所加入的3種菌劑皆為具有纖維素降解能力的菌屬，且存在能夠適應低溫條件或者馴化出耐低溫的菌屬，因此篩選前后菌屬數量保持一致.

2.3.3 復合菌系真菌微生物群落多樣性和結構組成差異性分析

復合菌系SL15、MM15、MS15的真菌群落(見圖11)主要隸屬子囊菌門、擔子菌門(Basidiomycota)兩個門. 與菌源中真菌微生物群落結構組成比較發現，子囊菌門在復合菌系SL15、MM15、MS15中仍為優勢菌，分別占真菌群落總數量的93.81%、96.59%、85.35%.菌源MM0、MS0中相對豐度極低的擔子菌門在復合菌系MM15、MS15中成為優勢菌門，尤其是在復合菌系MS15中，其相對豐度達到14.65%. 擔子菌門是植物木質部細胞壁成分(纖維素、半纖維素、木質素)降解的特有微生物，特別是白腐菌對降解植物中芳香木質素聚合物具有針對性[33]，進而促進了纖維素的降解. 這也是馴化篩選過程中MS處理組纖維素類物質降解率最高的原因之一. 在菌源SL0中真菌微生物種類較多，在測序分析中有4.71%的真菌未被鑒定，但由于適應環境條件和培養基條件得以保留，使SL15中擔子菌門的相對豐度降低. 已有研究[34-35]也表明，自然資源中仍然有許多未被發現的微生物，可能具有重要的生物學功能.

圖11 門分類水平上復合菌系真菌的群落組成Fig.11 The community composition of complex fungus at phylum level

復合菌系在屬水平上的細菌微生物群落組成如圖12所示. 結果顯示，SL15組真菌微生物群落多樣性同樣強于MM15及MS15組，3組樣品中出現的unclassified_f_Nectriaceae、unclassified_o_Hypocreales、unclassified_c_Sordariomycetes為復合菌系的優勢菌屬，分析可能是一些現階段未被發現的產纖維素酶的新菌株.

圖12 屬分類水平上復合菌系真菌的群落組成Fig.12 The community composition of complex fungus at genus level

SL15、MM15和MS15真菌菌屬的數量(見圖13)相對較少且相差不大. 其中有5個真菌菌屬為3個菌系所共有，如圖14所示，共有屬包括g_unclassified_f_Nectriaceae(占44.89%)、g_unclassified_c_Sordariomycetes(占44.80%)、g_Apiotrichum(占6.20%)和g_unclassified_o_Hypocreales(占3.90%). 與菌源相比，3組復合菌系真菌多樣性明顯降低，除篩選過程淘汰掉與秸稈降解無關的部分菌屬外，真菌菌屬可能對溫度較為敏感，不易馴化出耐低溫的纖維素降解菌.

圖13 復合菌系真菌物種Venn圖Fig.13 Venn chart of complex fungus

圖14 復合菌系真菌共有屬Fig.14 Complex bacteria of fungi common genus

2.3.4 復合菌系優勢菌群生態功能分析

變形菌門和厚壁菌門是纖維素降解菌群的主要門類，二者在纖維素降解的前、中、后期以此消彼長的動態變化協同降解纖維素. 擬桿菌門對碳水化合物具有較好的降解能力[36]，能夠分解蛋白胨或葡萄糖，產生琥珀酸、乙酸、甲酸、乳酸和丙酸等秸稈中間代謝產物，具有降解纖維素的能力[37]，在前期和中期參與纖維素的降解[28]. 變形菌門中的無色桿菌屬和厚壁菌門中的類芽孢桿菌屬通過分泌葡萄糖苷酶、水解酶、過氧化氫酶等消耗中間代謝產物(如纖維二糖、木糖、醛糖)，促進纖維素的持續降解[32]；變形菌門中的變形桿菌屬以及金黃桿菌屬中的大部分細菌均能夠產生較強活性金屬蛋白酶[38]，其對于農業廢棄物堆肥的有機物降解具有一定的作用.

與細菌相比，真菌的類群及數量相對較少，但真菌在土壤微環境中的作用十分重要. 木質素降解也是能否有效利用纖維素的關鍵. 對木質纖維素降解作用最為明顯的是真菌，從門水平來看，真菌群落微生物中的優勢菌屬為子囊菌門. 研究[39]表明，子囊菌門在真菌群落中存在數量最多，大多數為腐生菌，含有纖維素和木質素分解酶，可以將養分有效地分解為易吸收物質. 擔子菌門的真菌是少數具有降解木質素所需的木質纖維素分解酶的微生物[33].

細菌中的放線菌門對木質纖維素也具有較好的降解作用，它們對木質素的降解主要表現在初級代謝階段，在一定程度上使木質素結構改性，增加水溶性，從而提高對纖維素的降解[40]. 綜上，有些菌屬與纖維素降解沒有直接關系，只是因為適應篩選的培養基而得以保留，或通過與纖維素降解菌之間發生協同作用，使得復合菌系能夠穩定存在并且高效降解[29]. 添加外源纖維素降解菌劑不僅直接參與纖維素的降解，而且刺激了微生物群落的潛在功能和相互作用[41]，對于降解纖維素復合菌系的構建也是十分重要的.

3 結論

a) 通過馴化篩選獲得了3個在低溫(15 ℃)條件下穩定降解玉米秸稈中纖維素類物質的復合菌系SL15(以礦區土壤為菌源)、MM15(以纖維素降解菌劑為菌源)和MS15(以礦區土壤添加纖維素降解菌劑為菌源)，15 ℃下降解率分別為22.33%、26.33%和29.23%，其中復合菌系MS15的濾紙酶活性、內切酶活性最高分別可達4.692 5、2.226 7 U/mL.

b) 添加外源纖維素降解菌劑會對土著微生物形成協同增效，顯著增強分泌纖維素酶的能力，提高降解纖維素類物質的能力.

c) 變形菌門、擬桿菌門、厚壁菌門、子囊菌門和擔子菌門為各復合菌系的優勢菌門，鞘氨醇桿菌屬、金黃桿菌屬、布魯氏菌屬等能夠協同降解纖維素類物質. 復合菌系MS15中鞘氨醇桿菌屬及擔子菌門中菌屬的大量存在顯著促進了玉米秸稈中纖維素類物質的降解率.