高山兀鷲拉奎拉棒狀桿菌和腸球菌屬的分離鑒定

粟玉剛　李向勇　李蜜　劉彬　彭叢笑　夏青珍　劉友瓊

摘 要：從動物園發病死亡的高山兀鷲的肝臟、心臟血液、胰臟中分離到2種菌株。經形態學觀察、革蘭氏染色和分子生物學鑒定最終確定2種菌株分別為拉奎拉棒狀桿菌和腸球菌屬。本次試驗結果為高山兀鷲生物學特性研究提供了技術支撐。

關鍵詞：高山兀鷲、拉奎拉棒狀桿菌、腸球菌屬、分離鑒定

中圖分類號：S858.39? ? ?文獻標識碼：B 文章編號：1673-1085（2023）07-0054-04

高山兀鷲（Gypshimalayensis），又名喜馬拉雅兀鷲，鷹形目（Accipitriformes）、鷹科（Accipitridae）[1-2]、禿鷲亞科（Aegypiinae），屬于大型猛禽，國家二級保護鳥類，被列入瀕危野生動植物國際貿易公約（CITES公約）附錄Ⅱ限制貿易鳥類。高山兀鷲集中分布于我國的西部高山、高原地區，為不易歸類的分布型鳥，生活在海拔2 500～4 800 m區域。資料顯示生活在珠穆朗瑪峰自然保護區的高山兀鷲，秋季沿橫斷山脈向南遷徙至云南西部，或越過喜馬拉雅山脈到印度、緬甸等地越冬[3-4]。高山兀鷲體長120～150 cm，體重可達8～12 kg，于高空翱翔，飛行狀態時翼尖而長，略向上揚[5]，有時結小群活動，或停棲于多巖峭壁，以腐肉為食，對維持生態系統平衡有重要意義。本研究從動物園一例死亡的高山兀鷲的肝臟、心臟血液、胰臟等病料分離出細菌，經革蘭氏染色進行形態學觀察，并通過分子生物學檢測鑒定分離菌為拉奎拉棒狀桿菌和腸球菌屬，從而為高山兀鷲的疾病防治和動物園飼養提供理論依據和有益參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 長沙生態動物園一例死亡的高山兀鷲采集其肝臟、心臟血液、胰臟等臟器組織作為病料樣品。

1.1.2 主要試劑 血瓊脂培養基購自鄭州貝瑞特生物技術有限公司，藥敏紙片套裝購自常德比克曼生物科技有限公司，DL5000 marker購自北京索萊寶科技有限公司，Premix Taq? （TaKaRa Taq? Version 2.0）、Nuclease-free Water購自TakaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 細菌分離與革蘭氏染色鑒定 將死亡的高山兀鷲肝臟、心臟血液、胰臟等進行組織處理后嚴格按照無菌操作，用高溫灼燒后的接種環蘸取少量病變組織液在血瓊脂培養基上進行劃線接種，在37℃恒溫箱培養18 h后，分別挑取不同形態的單菌落并編號為1號、2號菌，通過平板劃線法再次接種于血瓊脂平板進行純化，挑取少量純化后的單菌落適當稀釋后進行革蘭氏染色鑒定。

1.2.2 細菌16S rDNA基因序列擴增 用無菌接種環分別挑取不同形態的純化后的1號、2號菌，接種于150 ?L滅菌超純水中混勻，按照DNA提取試劑盒提取細菌基因組DNA，根據先前研究[6]合成用于PCR擴增細菌16S rRNA基因序列的通用引物，16S rRNA-27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；16S rRNA-1492R：5'-GGCTACCTTGTTACGACTT-3'，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。PCR反應總體系25 ?L，包括Premix Taq? 12.5 ?L，上下游引物各0.5 ?L，DNA模板1.0 ?L，Nuclease-free Water 10.5 ?L。反應條件：94℃預變性5 min，94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸90 s，共35個循環，最后72℃再延伸5 min。PCR反應結束后取5.0 ?L PCR產物進行瓊脂凝膠電泳，觀察結果。將擴增的陽性PCR產物送至北京擎科生物科技有限公司測序，將測序回來的結果使用DNAMAN拼接好后，提交至NCBI進行Blast比對，同源性≥99%可以定義到種的水平；若同源性在97.0%～98.9%，可以定義到屬的水平；若同源性＜97.0%，則定義為科水平，鑒定標準按照同源性≥97.0%判定[7]。

2 結果

2.1 細菌形態及革蘭氏染色觀察結果

接種病料組織液后的血瓊脂培養基，經觀察發現表面長有兩種形態不同的菌落，1號菌落為圓形、灰白，呈水滴狀，革蘭氏陽性菌，鏡檢顯示兩端膨大呈棒狀，排列不規則，如圖1；2號菌落形狀不規則、灰白色，個別呈刺突狀，革蘭氏陽性菌，鏡檢呈圓形或橢圓形短鏈狀排列，如圖2。

2.2 PCR擴增及序列分析結果

用細菌通用引物對其16S rDNA基因序列進行擴增，凝膠電泳結果如圖3所示，菌1和菌2均擴增出大小約為1 500bp的片段，進一步測序分析結果發現該兩種菌株序列分別與已知拉奎拉棒狀桿菌和腸球菌屬同源性高于99%，提示獲得分離株為拉奎拉棒狀桿菌和腸球菌屬。同源性分析結果見表1。

3 討論

本試驗通過細菌形態、革蘭氏染色鑒定及PCR擴增及序列分析，從發病高山兀鷲的肝臟、心臟血液、胰臟中分離到拉奎拉棒狀桿菌和腸球菌屬2種菌株。關于拉奎拉棒狀桿菌在高山兀鷲糞便、病料等檢出的文獻研究較為少見[8]。腸球菌屬為當前益生菌研究的熱點，多種常見的腸球菌菌株已廣泛應用于多種發酵食品、藥物和微生態制劑當中[9]。對于高山兀鷲這種食腐食性猛禽，其腸道中的腸球菌屬對其消化腐食以及抑制腐食中病原菌所發揮的作用是值得深入研究的課題，其對于進一步研究高山兀鷲的生態習性等具有重要意義[10]。

拉奎拉棒狀桿菌和腸球菌屬的病原體大多毒力不高或致病性不強，一些是條件性致病菌，疾病的發生常與創傷或動物的免疫力低下有關。該例高山兀鷲死亡前經歷籠舍調整，由大的開放籠舍轉移到面積小的封閉籠舍，可能存在飛行等行為無法得到有效滿足這一誘因。此外結合剖檢結果，不排除其因機體抵抗力降低，伴隨細菌感染后發病死亡的可能。因此，在高山兀鷲圈養實踐中應從籠舍環境與其生活習性之間的關系及疫苗接種、飼養環境的消殺滅源等疫病防控措施作進一步探討，本研究為高山兀鷲的動物園飼養和疾病防治提供理論依據和有益參考。

參考文獻：

[1]? ?鄭光美.中國鳥類分類與分布名錄[M].3版. 北京：科學出版社，2017.

[2]? Bird Life International. Gyps himalayensis[EB/OL]. The IUCN red list of threatened species 2017.[2020-11-09].http：//dx.doi.org/10.2305/IUCN.UK.2017-3.RLTS.T22695215A118594518.en.

[3]? 胡慧建， 陳邵峰， 田園.活在世界之巔—珠穆朗瑪峰國家級自然保護區的野生動物[M].廣州： 南方日報出版社，2014：92.

[4]? 韓聯憲， 彭建生.納帕海的鳥[M].北京： 中國大百科全書出版社， 2014：90.

[5]? 王斌， 胡慧建， 李晶晶， 等.珠穆朗瑪峰國家級自然保護區鳥類[M].長沙：湖南師范大學出版社，2014：36.

[6]? Weisburg W， Barns S M， Pelletier D A， et al.16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study[J].Journal of bacteriology，1991，173（2）：697-703.

[7]? 王煒強，孫浩云， 楊志松.動物園梅花鹿源肺炎克雷伯氏菌的分離鑒定及耐藥性[J].野生動物學報，2022，43（01）：220-223.

[8]? Fernández-Garayzábal J F， Egido R， Vela A I， et al. Isolation of Corynebacterium falsenii and description of Corynebacterium aquile sp. Nov.， form eagles[J].International journal of systematic and evolutionary micrbiology，2003，53（4）：1135-1138．

[9]? 侯建平， 鄭思思， 龍鑫， 等.高山兀鷲腸道微生物分離鑒定與耐藥性分析[J].野生動物學報，2021，42（02）：460-469.

[10] 魯旭， 張影， 曾明．益生性腸球菌安全性評價研究進展與監管[J].中國藥事，2019，33（05）： 555-560．

第一作者簡介：粟玉剛（1985—），女，湖南長沙人，中級獸醫師，主要從事動物疾病治療與防治工作，E-mail：412635016@qq.com。

*通信作者簡介：李向勇（1981—），男，河南周口人，高級獸醫師，主要從事動物疾病治療與防治工作，E-mail：29778693@qq.com。