豬細小病毒S-1A株對細胞的適應性及其培養條件的優化

朱永軍 張婉華 林鷙 何錫忠 彭麗英

摘 ?要：將豬細小病毒S-1A株在不同的細胞中培養，測定病毒含量，以確定適合豬細小病毒S-1A株增殖的細胞。結果表明：豬細小病毒S-1A株能在豬腎傳代細胞系（PK-15）、豬腎原代細胞（PK）、豬睪丸細胞（ST）和仔豬腎細胞（IBRS-2）中生長增殖，不能在幼倉鼠腎細胞系（BHK-21）、綠猴腎細胞（Vero）和雞胚成纖維細胞（CEF）中增殖；當ST細胞生長至2/3單層時，將豬細小病毒S-1A株種毒液100倍或1 000倍稀釋后接種ST細胞，37 ℃培養96～144 h，獲得的病毒載量最高。

關鍵詞：豬細小病毒S-1A株；ST細胞；培養條件

中圖分類號：S816.79 文獻標志碼：A 文章編號：1001-0769（2023）03-0041-04

豬細小病毒（porcine parvovirus，PPV）是引起母豬繁殖障礙的主要病原體之一[1]。1966年，Mayr在進行豬瘟病毒組織培養時首次發現PPV，通過核酸鑒定證明為DNA病毒[2]。豬細小病毒病的主要特征是懷孕母豬發生流產、死產、胚胎死亡和胎兒木乃伊化，而母豬本身不表現臨床癥狀，其他豬感染后也無明顯的臨床癥狀[3-4]。

豬細小病毒能在豬的細胞（包括豬睪丸細胞、豬腎原代細胞及傳代細胞系）和人的某些傳代細胞系中培養增殖[1]，適合在正處于有絲分裂期的細胞內增殖。細胞感染豬細小病毒后初期呈現彌漫性顆粒樣病變，隨后細胞圓縮、拉網、脫落。1982年，上海市農業科學院畜牧獸醫研究所用仔豬腎原代細胞從上海郊區某豬場所產的死胎中分離到一株PPV，將其在細胞上連續傳代、純化，獲得一株具有良好的免疫原性的PPV強毒株，命名為PPVS-1A株。本研究將PPVS-1A株在不同的細胞內培養，以獲得一種適合該病毒的細胞，并優化其培養條件。

1 ?試驗材料

1.1 細胞與病毒

豬腎傳代細胞系（PK-l5）、豬睪丸細胞（ST）、仔豬腎細胞（IBRS-2）、綠猴腎細胞（Vero）、幼倉鼠腎傳代細胞系（BHK-21），均由本實驗室保存。豬腎原代細胞（PK）、雞胚成纖維細胞（CEF），均由本實驗室按常規方法制備。

PPVS-1A株由本實驗室分離鑒定、傳代并保存。

1.2 培養基

DMEM培養基、新生牛血清，購自GIBCO公司；胰酶購自Sigma公司。

細胞生長液為含10％新生牛血清的DMEM培養基。細胞維持液為含2％新生牛血清的DMEM培養基。

2 ?試驗方法

2.1 細胞接種

按常規方法培養或制備PK-15、BHK-21、IBRS-2、PK、ST、Vero和CEF細胞單層。用PPVS-1A株病毒液接種細胞，置37 ℃、5％ CO2培養箱中培養，每天觀察細胞病變效應并記錄。當細胞病變效應達75％以上時，收獲細胞培養物，并測定病毒含量；沒有細胞病變效應的細胞均于接毒后7 d收獲，－70 ℃凍融3次后傳代，盲傳3代，每代均觀察有無細胞病變效應。

2.2 病毒含量測定

用細胞生長液將種毒液作10倍系列稀釋，4個稀釋度10－4、10－5、10－6、10－7 ，分別接種有絲分裂期的相應細胞（96孔細胞培養板），每個稀釋度接種4孔，每孔0.1 mL，同時設細胞陰性對照孔，接種后，置37 ℃、5％ CO2培養箱中培養5～7 d，每天觀察細胞病變效應，測定病毒半數組織培養感染劑量（50％ tissue culture infectious dose，TCID50）。

2.3 血凝試驗

在96孔板的第1孔至第12孔，每孔加入磷酸鹽緩沖液（0.01 M，pH＝7.4）0.05 mL，取被檢樣品0.05 mL，從第1孔起，依次作 ? 2倍系列稀釋，至最后一個孔，每孔加入0.5％豚鼠紅細胞懸液0.05 mL，并設紅細胞對照孔，搖勻，置25～28 ℃作用35～45 min后觀察結果，并記錄。

2.4 最佳接毒劑量的確定

將PPVS-1A株種毒液分別稀釋10倍、100倍、1 000倍、10 000倍后接種ST細胞，觀察細胞病變效應。當75％以上的細胞出現細胞病變效應時收獲細胞毒液，－70 ℃反復凍融3次，分別測定TCID50。TCID50最高的接毒劑量為最佳接毒劑量，且血凝效價大于1∶1 024。

2.5 最佳接毒時間的確定

分別采用病毒與ST細胞同步接種、形成2/3細胞單層接種及形成良好單層接種這三種方法來接種PPVS-1A株病毒液，37 ℃培養。當75％以上的細胞出現細胞病變效應時收獲細胞毒液，－70 ℃反復凍融3次，分別測定TCID50。TCID50最高的接毒時間為最佳接毒時間，且血凝效價大于1∶1 024。

2.6 最佳收毒時間的確定

將PPVS-1A株病毒液接種ST細胞，分別于37 ℃培養60 h、72 h、84 h、96 h、120 h、144 h后收獲細胞毒液，－70 ℃反復凍融3次后，分別測定其病毒含量（TCID50），以TCID50最高者的收毒時間為最佳收毒時間，且血凝效價大于1∶1 024。

3 ?試驗結果

3.1 細胞適應性結果

將PPVS-1A株病毒液接種PK-15、PK、ST、IBRS-2細胞，第1代細胞均出現細胞病變效應，主要表現為細胞圓縮、拉網、脫落，當細胞病變效應達到75％以上時收獲細胞培養物。接種BHK-21、Vero和CEF細胞均未出現細胞病變效應，盲傳3代也未有細胞病變效應。

3.2 病毒含量測定結果

取上述細胞培養物，凍融3次后接種同種細胞，計算病毒含量。ST細胞增殖的病毒含量為107.50 TCID50/mL；PK-15細胞增殖的病毒含量為107.25 TCID50/mL；PK細胞增殖的病毒含量為107.00 TCID50/mL；IBRS-2細胞增殖的病毒含量為106.25 TCID50/mL；其他幾種細胞接種后均未出現細胞病變效應，盲傳3代的原代培養物均未測出PPVS-1A株病毒。

3.3 最佳接毒劑量

試驗結果顯示，種毒液稀釋10倍后接種細胞，收獲細胞時測得的病毒含量為106.00～106.25 TCID50/mL；種毒液稀釋100倍后接種細胞，收獲細胞時測得的病毒含量為107.00～107.50 TCID50/mL，且血凝效價均大于1∶1 024；種毒液稀釋1 000倍后接種細胞，收獲細胞時測得的病毒含量為107.00～ ? ?107.50 TCID50/mL，且血凝效價大于1∶1 024；種毒液稀釋10 000倍后接種細胞，收獲細胞時測得的病毒含量為106.00～106.75 TCID50/mL。試驗表明，最佳接毒劑量為種毒液稀釋100或1 000倍。詳見表1。

3.4 最佳接毒時間

結果顯示，細胞形成2/3單層時接種病毒，病毒含量最高，且血凝效價大于1∶1 024。其次是同步接種，最后是形成良好單層時接種。試驗表明，細胞形成2/3單層時接種PPVS-1A株最佳。詳見表2。

3.5 最佳收毒時間

結果表明，接毒后96～144 h收毒，細胞病變效應可達75％以上，病毒含量在107.25 TCID50/mL以上，且血凝效價大于1∶ 1 024。詳見表3。

4 ?討論

本研究對細胞適應性得出的結果與Bergeron等[5]、Cartwright等[6]和Wu等[7]國內外學者的研究結果相似，結果表明，PPVS-1A株能在PK-15、PK、ST和IBRS-2等豬源細胞中增殖，不能在BHK-21、Vero和CEF細胞中增殖。PK細胞是原代細胞，制備繁瑣且原材料來源受限；IBRS-2細胞增殖的病毒含量較低；PK-15細胞增殖的病毒含量較高，但PK-15細胞易于污染豬圓環病毒；ST細胞為傳代細胞系，細胞形態好，生長快，易于培養，增殖的病毒含量較高。因此，本研究選用ST細胞系來增殖PPVS-1A株。

根據試驗結果，PPVS-1A株在ST細胞系上的最佳培養條件為：在細胞形成2/3單層時接種培養，種毒液稀釋100倍或1 000倍后接種，置37 ℃培養96～144 h。

趙潤澤等[8]和趙文影等[9]對河南、北京、江蘇、安徽等地區PPV流行情況進行調查，結果顯示2021年的PPV核酸檢出率比2020年的明顯升高，說明目前豬細小病毒病已普遍存在于豬群中，給養豬業造成了巨大的經濟損失。本研究對PPVS-1A株的細胞適應性和在ST細胞系上的最佳培養條件的研究為豬細小病毒病疫苗的研發提供了基礎。

參考文獻

[1] 殷震，劉景華．動物病毒學[M]．２版．北京：科學出版社，1997．

[2] MAYR A，MAHNEL H．Cultivation of hog cholera virus in pig kidney cultures with cytopathogenic effect[J]．Zentralbl Bakteriol Originate，1964，195（2）：157-166．

[3] STRECK A F，TRUYEN U． Porcine Parvovirus[J]．Current Issues in Molecular Biology，2020，37：33-46．

[4] MENGELING W L，LAGER K M，VORWALD A C．The effect of porcine parvovirus and porcine reproductive and respiratory syndrome virus on porcine reproductive performance[J]．Animal Reproduction Science，2000（60/61）：199-210．

[5] BERGERON J，HEBERT B，TIJSSEN P．Genome organization of the Kresse strain of porcine parvovirus： identification of the allotropic determinant and comparison with those of NADL-2 and field isolates[J]．Journal of Virology，1996，70（4）：2508-2515．

[6] CARTWRIGHT S F，LUCAS M，HUCK R A．A small haemagglutinating porcine DNA virus. I. Isolation and properties[J]．Journal of Comparative Pathology，1969，79（3）：371-377．

[7] WU Y F，ZHU L，XU Z W，et al．Proliferation characteristics of a PK-15 cell-adapted strain of porcine parvovirus[J]．Bing Du Xue Bao，2013，29（4）：357-363．

[8] 趙潤澤，同珂，李文靜，等．湖北地區豬細小病毒流行病學調查[J]．安徽農業科學，2021，49（8）：83-85．

[9] 趙文影，張云靜，白小飛，等．豬細小病毒BJ2株的分離鑒定及全基因組序列分析[J]．河南農業科學，2023，52（2）：136-144．