羊傳染性膿皰口炎病毒株的分離鑒定

李紅 林鷙 何錫忠 ，林月霞 呂玉華 彭麗英

摘 ?要：利用牛腎（Madin-Darby bovine kidney，MDBK）細(xì)胞對上海市崇明區(qū)某羊場的痂皮病例進(jìn)行病毒分離，獲得一株羊口瘡病毒（orf virus，ORFV），命名為ORFVSH-01。參考NCBI數(shù)據(jù)庫中ORFV的保守基因B2L的序列，設(shè)計(jì)一對特異性引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測序。結(jié)果表明：接種病料懸液的MDBK細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞病變，成功分離到毒株；經(jīng)PCR擴(kuò)增和測序，分離的毒株為ORFV，命名為ORFVSH-01。

關(guān)鍵詞：羊口瘡病毒；分離鑒定；PCR

中圖分類號：S815 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A ? ? ? 文章編號：1001-0769（2023）03-0066-04

羊傳染性膿皰口炎，又稱羊口瘡，是由羊口瘡病毒（orf virus，ORFV）引起山羊、綿羊以及中小反芻動物的一種接觸性、嗜上皮性傳染病，也是一種人畜共患病，可感染綿羊、山羊、大角羊、巖羚羊、駱駝、麝香牛、鹿和人，1～ 3月齡的羔羊更易感，以口唇、舌、鼻、乳房、蹄及外陰等部位形成丘疹、膿皰、水皰及結(jié)成疣狀結(jié)痂為特征，嚴(yán)重影響病羊的采食和吸乳，會繼發(fā)或混合感染其他的病原微生物，最終導(dǎo)致羔羊死亡[1-2]。該病發(fā)病率50％，死亡率較高，常呈群發(fā)性流行，嚴(yán)重影響?zhàn)B羊業(yè)發(fā)展。近年來，該病在世界各地呈不斷上升趨勢，感染的宿主范圍在逐漸擴(kuò)大[3]，對人類健康也構(gòu)成了威脅，引起了國內(nèi)外相關(guān)研究人員的廣泛關(guān)注[4]。

ORFV屬于痘病毒科脊椎動物痘病毒亞科副痘病毒屬成員，是一種具有囊膜的雙鏈DNA病毒，全基因組長135.0～148.1 kb，可編碼多種蛋白。其中B2L基因全長1 137 bp，是一個(gè)重要的保護(hù)性抗原基因，可以刺激機(jī)體產(chǎn)生良好免疫反應(yīng)[5-6]。研究表明，不同國家或地區(qū)分離到的ORFV的基因差異較大，不同分離株基因組長度有10～25 kb的差異，致病性也存在較大差異，造成市場上現(xiàn)售的疫苗對一些感染變異株的羊群免疫保護(hù)效果不佳。

我國新疆、西藏、甘肅、內(nèi)蒙、吉林、四川、云南、陜西等地對該病都有過報(bào)道。2019年11月，上海市某羊場的羊疑似發(fā)病，口唇和舌頭處發(fā)生潰瘍、生瘡，有的已形成痂皮或疣狀病變。該羊場曾免疫羊傳染性膿皰口炎弱毒疫苗，因此該場羊群的發(fā)病率雖然較高，但死亡率較低。根據(jù)羊群的臨床特征和分子生物學(xué)檢測結(jié)果，診斷為羊口瘡。本試驗(yàn)通過病料接種細(xì)胞獲得致病毒株，并對羊傳染性膿皰口炎病毒進(jìn)行了鑒定。

1 材料

1.1 細(xì)胞與病料

牛腎（Madin-Darby bovine kidney，MDBK）細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存。病料為上海市崇明區(qū)某羊場疑似患羊口瘡山羊的唇部痂皮。

1.2 主要試劑

DMEM高糖培養(yǎng)基、小牛血清、胰酶為Gibco公司提供；Premix Taq?、DNA Marker DL2000購自TaKaRa公司；病毒DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自天根生物科技有限公司。

1.3 病毒

PCR陽性對照病毒購自山東泰豐生物制品有限公司的羊口瘡病毒疫苗毒株。

1.4 主要儀器

主要儀器有Retiga 2000R高敏感度冷CDD熒光數(shù)碼顯微鏡（日本OLYMPUS公司）、GeneAmp PCR System 9700擴(kuò)增儀（美國Applied Biosytems公司）、紫外凝膠成像系統(tǒng)（法國 Vilber Lourmat公司）、DYY-6C型電泳儀（北京市六一儀器廠）。

2 ?試驗(yàn)方法

2.1 病料處理

取病羊唇部痂皮，用PBS緩沖液 ? ? （0.01 mol/L）反復(fù)沖洗幾次，用無菌剪刀剪碎，加入少量PBS緩沖液進(jìn)行研磨，加入青霉素和鏈霉素（終濃度1％），用PBS緩沖液將研磨液稀釋為懸液，于－70 ℃反復(fù)凍融3次后，5 000 r/min 離心10 min，取上清液，用孔徑0.22 μm的濾器過濾，獲病料懸液置于－20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 病毒分離

MDBK細(xì)胞用含10％小牛血清的DMEM培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)至狀態(tài)良好，待細(xì)胞鋪滿細(xì)胞瓶單層，接種2.1中處理好的病料懸液1 mL，置于37 ℃、5％CO2培養(yǎng)箱中吸附1 h，加入含2％小牛血清的DMEM維持液9 mL，置于37 ℃、5％CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞生長和細(xì)胞形態(tài)的變化，同時(shí)設(shè)未接毒細(xì)胞為陰性對照。當(dāng)75％細(xì)胞圓縮時(shí)收毒，－20 ℃凍融3次，收集病毒液，于－70 ℃保存。若細(xì)胞在接種病料后5 d內(nèi)未出現(xiàn)病變，則連續(xù)盲傳3代，直到細(xì)胞出現(xiàn)明顯細(xì)胞病變，收集病毒液置于－70 ℃保存，繼續(xù)傳代；若盲傳3代后無細(xì)胞病變則棄之。

2.3 病毒純化

將2×DMEM（含4％胎牛血清）放入37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)預(yù)熱；將3％瓊脂在水浴鍋中溶解后放入43 ℃燒杯水中預(yù)熱。將病毒液做10倍稀釋，即從10-1稀釋至10-7，從10-3至10-7每個(gè)稀釋度的稀釋液中各取1 mL，依次加到6孔板中，每個(gè)稀釋度一孔，設(shè)未接毒細(xì)胞為對照組；37 ℃培養(yǎng)1～2 h，棄病毒吸附液，用無血清的DMEM洗滌2次。取10 mL瓊脂和10 mL DMEM等量混合，每孔加入2 mL瓊脂與DMEM培養(yǎng)基混合液；37 ℃孵育，最低稀釋度出現(xiàn)蝕斑時(shí)，收集蝕斑；用500 μL PBS溶解， －70 ℃凍融細(xì)胞3次，收集病毒液，提取病毒DNA，進(jìn)行PCR鑒定。取陽性的蝕斑連續(xù)傳6代，并將各代次病毒液分別凍存于－70 ℃。

2.4 引物設(shè)計(jì)與合成

參照文獻(xiàn)[14]對羊口瘡病毒的B2L基因設(shè)計(jì)1對特異性引物，由生工生物工程（上海）有限公司合成。上游引物：5'-ATGTGGCCGTTCTCCTC-3'，下游引物：5'-TTAATTTATTGGTTTGCAGAACT-3'。

2.5 病毒PCR鑒定

按照病毒DNA提取試劑盒說明書，分別從疫苗毒株、病料懸液的上清液和第1～6代傳代細(xì)胞病毒液中提取DNA。以提取的病毒基因組DNA為模板擴(kuò)增目的片段，PCR反應(yīng)體系為：2×Premix Taq? 25 μL、上下游引物各 ? ? 2 μL、DNA模板6 μL、ddH2O 15 μL，反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s、53 ℃ 30 s、72 ℃ 90 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。取6 μL PCR產(chǎn)物在8 g/L瓊脂糖凝膠上電泳，對擴(kuò)增出目的條帶的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序。

3 ?結(jié)果

3.1 病毒分離

將病料懸液接種MDBK細(xì)胞后，第1代細(xì)胞未出現(xiàn)病變，72 h后收毒并盲傳第2 代，從第2代開始出現(xiàn)細(xì)胞病變，病變出現(xiàn)時(shí)間在48 h左右，傳到第6代時(shí)細(xì)胞病變時(shí)間變得有規(guī)律，細(xì)胞病變出現(xiàn)時(shí)間在40 h左右，表現(xiàn)為：胞核濃縮、變圓、團(tuán)聚、拉網(wǎng)，最后脫落，未接毒的陰性對照細(xì)胞表現(xiàn)正常，詳見圖1。將該病毒分離株命名為ORFVSH-01。

3.2 病毒純化

病毒液稀釋至10-4時(shí)接種細(xì)胞，第一代細(xì)胞出現(xiàn)蝕斑，繼續(xù)傳代至第6代，隨著傳代次數(shù)的增加，蝕斑的出現(xiàn)更加有規(guī)律，病毒液稀釋至10-6時(shí)接種細(xì)胞均出現(xiàn)蝕斑。

3.3 PCR檢測及測序結(jié)果

以陰性對照（未接毒正常細(xì)胞）、陽性對照（疫苗毒株）和分離毒株（第6代蝕斑）分別提取的病毒基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示，擴(kuò)增出1 137 bp左右的目的片段（圖2）。測序序列經(jīng)NCBI核酸序列比對后，顯示與ORFA核酸序列同源性最高，說明分離的病毒為ORFV。

4 ?結(jié)論

ORFV可以用不同的原代細(xì)胞或傳代細(xì)胞系進(jìn)行培養(yǎng)。原代細(xì)胞以初生羔羊睪丸細(xì)胞和初生羔羊腎細(xì)胞為主，牛腎細(xì)胞系被認(rèn)為是病毒分離和傳代培養(yǎng)常用的細(xì)胞系[7]。ORFV的B2L基因序列高度保守，有文獻(xiàn)報(bào)道，不同來源的羊口瘡病毒B2L基因僅有個(gè)別堿基存在差別，因此，B2L基因常用于鑒定ORFV[5-6]。本試驗(yàn)采用MDBK細(xì)胞對羊唇部結(jié)痂進(jìn)行病毒分離，經(jīng)過6代純化獲得了純化病毒，通過對ORFV的B2L基因的擴(kuò)增、測序，證明從羊唇部結(jié)痂中分離到的毒株為ORFV，將其命名為ORFVSH-01。

疫苗免疫接種是預(yù)防羊傳染性膿皰口炎的主要手段，常用的有弱毒疫苗和滅活疫苗。隨著病毒毒力的返強(qiáng)、病毒變異株的出現(xiàn)，羊傳染性膿皰口炎在各地羊群中呈暴發(fā)性流行，給養(yǎng)羊業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。ORFVSH-01毒株的獲得為今后羊口瘡疫苗研制打下了良好的基礎(chǔ)，為該病的防控提供了技術(shù)保障。

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