仔豬副豬嗜血桿菌的分離鑒定及耐藥性檢測

仁增旺姆

摘 ?要：為了了解海南藏族自治州共和縣規模化豬場中仔豬副豬嗜血桿菌分離株的流行情況及對常用抗菌藥的耐藥情況。本試驗于2022—2023年采集海南藏族自治州共和縣規模化豬場中患疑似副豬嗜血桿菌病的仔豬鼻拭子、關節液、胸腔積液、肺臟等病料，共計283份。采用細菌分離鑒定、PCR方法對采集的病料進行副豬嗜血桿菌分離鑒定，采用人工感染小鼠試驗驗證分離株的致病性，采用紙片擴散法（Kirby-Bauer，簡稱K-B法）檢測致病性副豬嗜血桿菌分離株對臨床中常用抗菌藥的耐藥性。結果顯示：從采集的283份病料中分離到128株副豬嗜血桿菌，通過致病試驗顯示，91株副豬嗜血桿菌能引起小鼠不同程度發病與死亡，為致病性菌株；分離的91株致病性副豬嗜血桿菌對磺胺間甲氧嘧啶、阿莫西林、氨芐西林等6種藥物的耐藥率為85.7％以上，對其他藥物的耐藥率為3.3％～25.3％，本研究為該地區仔豬副豬嗜血桿菌合理用藥及防控提供參考。

關鍵詞：仔豬；副豬嗜血桿菌；致病性；藥敏試驗

中圖分類號：S855.1+2 文獻標志碼：A 文章編號：1001-0769（2023）03-0053-03

仔豬副豬嗜血桿菌病是由不同血清型的副豬嗜血桿菌引起的豬的一種傳染性呼吸道疾病，也是養豬生產過程中常見的細菌性傳染病之一。副豬嗜血桿菌可以通過不同的途徑感染不同生產階段的豬，仔豬最易感，感染率和死亡率均較高，尤其對4～8周齡的仔豬危害較厲害，仔豬感染后臨床上的常見癥狀為纖維素性胸膜炎、呼吸困難和關節炎等，會給養豬業造成嚴重的經濟損失[1-3]。相關研究表明，在養豬生產過程中，仔豬的副豬嗜血桿菌病經常與豬圓環病毒病、豬瘟、豬繁殖與呼吸綜合征等免疫抑制性病毒性疾病混合發生，加快發病動物的死亡，給臨床診斷帶來一定的困難[4-5]。

仔豬副豬嗜血桿菌病在世界不同國家的豬場廣泛流行，已經成為多個國家和地區普遍流行的豬病之一，不同的國家與地區流行的仔豬副豬嗜血桿菌血清型具有差異性[6-7]。在臨床上，仔豬副豬嗜血桿菌具有多種血清型，在疫苗制備上存在一定的困難，防控仔豬副豬嗜血桿菌病主要通過抗生素，隨著抗菌藥的廣泛應用，已經產生嚴重的耐藥性，給仔豬副豬嗜血桿菌病的臨床治療帶來了一定的困難，給人類的健康也帶來嚴重的危害[6]。

本試驗于2022—2023年采集海南藏族自治州共和縣規模化豬場中疑似患副豬嗜血桿菌病的仔豬鼻拭子、關節液、胸腔積液、肺臟等病料組織共計283份，對仔豬副豬嗜血桿菌進行分離鑒定，并分析其耐藥性，以期對海南藏族自治州共和縣仔豬副豬嗜血桿菌病的綜合防控提供參考。

1 ?材料與方法

1.1 菌株來源

2022—2023年，從青海省海南藏族自治州共和縣規模化豬場疑似患副豬嗜血桿菌病的仔豬上，采集鼻拭子、關節液、胸腔積液、肺臟等病料樣本，共計283份。

1.2 細菌分離與培養

在無菌的條件下，將采集的各種樣本接種于巧克力培養基，挑取巧克力培養基上單個的典型菌落接種于胰酪大豆胨 （tryptone soy broth，TSB）液體培養基中進行純化培養， ?37 ℃下震蕩培養12～18 h，取菌液進行革蘭染色鏡檢和生化特性鑒定。

1.3 細菌PCR鑒定

參照王同兆等[8]推薦的副豬嗜血桿菌鑒定引物，引物序列如下：F1：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAGG-3'；F2：5'- TACGGCTACCTTGTTTTG-3'，由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。取純化培養的副豬嗜血桿菌分離株，用水煮沸提取分離株的基因組DNA，以提取的基因組DNA為模板進行PCR鑒定。

1.4 致病性試驗

參照王麗榮等[9]的方法，將臨床上分離的副豬嗜血桿菌分離株接種于TSB液體培養基中，培養至對數生長期，調整菌液濃度至106 CFU/mL。攻毒組每株分離株腹腔注射2只昆明系小鼠，劑量為0.25 mL；對照組昆明系小鼠腹腔注射等量的無菌生理鹽水。試驗期為6 d，試驗期間觀察小鼠的發病情況，對死亡的小鼠進行細菌學鑒定。

1.5 藥敏試驗

紙片擴散法（Kirby-Bauer，簡稱K-B法）參照美國臨床實驗室標準化協會（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）的要求對副豬嗜血桿菌分離株進行藥敏試驗和結果判定。

2 ?結果

2.1 細菌分離培養

疑似副豬嗜血桿菌的分離株在巧克力培養基上生長出圓形、隆起、整齊、表面光滑的灰白半透明的菌落；利用革蘭染色鏡檢觀察其形態學，發現分離株呈桿狀、短桿狀等多形性形態的革蘭陰性菌，與報道的副豬嗜血桿菌培養特性及形態學基本上一致。生化特性鑒定結果顯示，分離株為副豬嗜血桿菌。

2.2 細菌PCR鑒定

用PCR法對疑似副豬嗜血桿菌的分離株進一步鑒定。結果顯示，臨床上分離到的 ? ? 128株疑似副豬嗜血桿菌的分離株均擴增出大約為320 bp的目的條帶（圖1）。對分離株的PCR產物進行測序，同源性比對顯示，128株分離株均為副豬嗜血桿菌，分離率為45.2％（128/283）。

2.3 致病性試驗

攻毒后2～4 d，攻毒組小鼠出現了精神沉郁、采食量減少、呼吸困難等不同的臨床癥狀，個別小鼠死亡。死亡小鼠剖檢可見肺臟、肝臟、腎臟、脾臟等臟器有不同程度的出血，并可分離得到副豬嗜血桿菌；對照組小鼠無臨床癥狀健康存活。經統計，91株副豬嗜血桿菌能引起小鼠發病和死亡，為致病性副豬嗜血桿菌。

2.4 耐藥性試驗

用K-B法檢測致病性副豬嗜血桿菌分離株對臨床常用抗菌藥耐藥性分析，結果見表1。

由表1可知，分離的91株致病性副豬嗜血桿菌對臨床中常用的藥物具有不同的耐藥性，其中對磺胺間甲氧嘧啶、阿莫西林、氨芐西林、多西環素等、恩諾沙星、環丙沙星6種藥物的耐藥率介于85.7％～98.9％，對頭孢噻呋、頭孢噻肟、頭孢曲松、替米考星、氟苯尼考、多黏菌素、大觀霉素、林可霉素8種藥物的耐藥率為3.3％～25.3％。

3 ?討論

副豬嗜血桿菌為臨床中常見的條件性致病菌之一，有多種血清型，廣泛存在于自然的飼養環境（空氣、糞便、污水）中，主要定植于豬的上呼吸道，可以通過多種途徑（直接接觸、空氣、飼料和飲水等）在不同豬之間傳播，當豬的免疫力下降時，容易引發副豬嗜血桿菌病[1]。副豬嗜血桿菌病為養豬生產中常見的傳染性疾病之一，具有發病急、死亡率較高等特點，嚴重危害我國養殖業的發展[10]。近幾年，關于仔豬副豬嗜血桿菌病的報道越來越多。本試驗從采集的283份病料樣本中分離到91株致病性副豬嗜血桿菌，說明副豬嗜血桿菌在該地區豬場中流行嚴重，應注意副豬嗜血桿菌病的疫苗接種與綜合防控。藥敏試驗顯示，分離的91株致病性副豬嗜血桿菌對磺胺間甲氧嘧啶、阿莫西林、氨芐西林等6種藥物的耐藥率為85.7％～98.9％，對其他被檢藥物耐藥率為3.3％～25.3％。在臨床上，在防治副豬嗜血桿菌病時應進行藥敏試驗，選用敏感的藥物，并交替使用，同時應配合環境的消毒，提高其治療效果。

參考文獻

[1] 肖敏，劉建，盧昌，等．副豬嗜血桿菌的分離鑒定與滅活疫苗的初步研制[J]．動物醫學進展，2022，43（8）：35-40.

[2] 趙自亮，田宇森，莊鴻琨，等．副豬嗜血桿菌與PCV3混合感染的實驗室診斷及分析[J]．中國動物檢疫，2022，39（12）：18-25.

[3] 范春梅．湖南省部分家庭豬場呼吸道疾病流行病學調查分析[J]．中國豬業，2020，15（5）：80-83.

[4] 杜炎斌，袁麗英，東笑，等．英德市某規模化豬場副豬嗜血桿菌分離鑒定及藥敏試驗[J]．動物醫學進展，2022，43（6）：32-36.

[5] 馮建遠，吳廷瑛，郭旋，等．廣西規模化豬場呼吸道病原菌調查及耐藥性分析[J]．中國豬業，2020，15（2）：66-69.

[6] 陳超群，陳佳莉，周萱儀，等．β-內酰胺類藥物對副豬嗜血桿菌流行病學臨界值的建立及耐藥性的測定[J]．畜牧獸醫學報，2021，52（11）：3234-3245.

[7] 王慶云．安陽地區副豬嗜血桿菌分離株的耐藥性與耐藥基因檢測[J]．動物醫學進展，2021，42（4）：131-134.

[8] 王同兆，張付賢，雷連成．1株副豬嗜血桿菌血清4型的分離鑒定及耐藥性分析[J]．中國畜牧獸醫，2022，49（3）：1096-1105.

[9] 王麗榮，董永軍，張守平，等．副豬嗜血桿菌試驗感染KM小鼠及在其體內的分布[J]．中國獸醫雜志，2020，56（11）：43-46，122.

[10] 解金秋，馬立孔，孫福方．某規模化豬場副豬嗜血桿菌分離鑒定及藥敏試驗[J]．中國豬業，2023，18（1）：76-78.