一種檢測飼料中聚醚類抗生素的液相色譜-串聯質譜方法

陳彤 鐘名琴 邱永為 何玉榆 黃婷

摘 ?要：本研究基于液相色譜－串聯質譜建立了一種高精密度檢測飼料中聚醚類抗生素的方法，并對所建立的方法進行了方法學的考察與驗證，參考已有的標準，對標準的相關處理步驟進行優化，采用液相色譜－串聯質譜法進行分析。馬杜霉素、莫能菌素、鹽霉素和甲基鹽霉素的標準曲線相關系數分別為0.999 79、0.999 71、0.998 52、0.999 38，方法檢出限分別為3.58 μg/kg、2.47 μg/kg、3.32 μg/kg、2.82 μg/kg，回收率范圍為90.4％～101.5％、89.2％～102.0％、90.5％～101.0％、88.3％～103.0％，相對標準偏差為1.2％～1.3％、1.4％～2.2％、1.5％～3.2％、1.9％～3.8％。所得結果表明，該方法具有檢出限低、回收率較好、精準度高、重復性好的優點，可以為檢測飼料中聚醚類抗生素提供有力的方法支撐。

關鍵詞：聚醚類抗生素；液相色譜－串聯質譜；精密度；回收率

中圖分類號：S859.84 文獻標志碼：A ? ? ? 文章編號：1001-0769（2023）03-0070-04

聚醚類抗生素（polyether antibiotics，PEs）是20世紀70年代發展起來的一類具有離子載體性質的抗生素，由鏈霉菌等微生物發酵產生，包括莫能菌素、馬杜霉素、鹽霉素和甲基鹽霉素等，是一類被廣泛應用于畜禽飼養行業中的廣譜抗球蟲藥和促生長劑[1-3]。從化學結構上看，此類藥物分子含有若干環狀醚鍵，分子一側帶有羧基，故而容易與Na+、K+等離子結合形成多種金屬鹽，不溶于水，易溶于低級醇、丙酮、氯仿、苯、乙醚、石油醚、乙酸乙酯、四氯化碳及正己烷等有機溶劑，且在堿性或中性條件下穩定存在。它們能與球蟲細胞中的陽離子緊密結合，改變細胞膜上脂質屏障的滲透性，增加向球蟲細胞內運輸離子，為了平衡滲透壓，大量水分進入球蟲細胞內，導致球蟲腫脹而死亡，因此也被稱為離子載體類抗球蟲藥[4]。其對球蟲子孢子第一代、第二代裂殖子有抑殺作用，同時又能有效促進動物的生長，提高畜禽產品的飼料利用率，提高養殖場經濟效益，故被廣泛添加于飼料中。但是，聚醚類抗生素本身在毒理學上屬于高毒或劇毒物質，具有較強的細胞毒性，因此藥物的安全范圍非常窄。過量使用聚醚類抗生素容易導致其在動物產品中殘留，并通過食物鏈在人體中蓄積，會嚴重危害人體健康。因此，研究聚醚類藥物在飼料中殘留量的檢測技術，對保障畜禽產品質量安全有著重要的意義[5-6]。

如今，聚醚類抗生素的殘留分析方法主要包括微生物檢測法、免疫學法、分光光度法、高效液相色譜法、高效液相色譜-串聯質譜法等[7-9]。其中，高效液相色譜-串聯質譜法將色譜的高分離能力與質譜的高靈敏度和高選擇性優點相結合，不但對樣本的前處理要求低，而且可以同時測定多種藥物殘留；該方法抗干擾能力強，靈敏度高，既可以完成對藥物的定性，又可以達到定量的效果，減少了測定的時間，提高了檢測質量，是一種非常優秀的測定多種聚醚類抗生素的方法。

本研究以農業部1862號公告-4-2012《飼料中5種聚醚類藥物的測定液相色譜-串聯質譜法》為基礎，在保證檢測結果準確可靠的前提下，優化了前處理的操作，并使用高效液相色譜-串聯質譜法對飼料中的馬杜霉素、莫能菌素、鹽霉素以及甲基鹽霉素進行定性定量檢測，提高了檢測效率，為聚醚類藥物的檢測提供有力的技術支持[10]。

1 ?材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器

安捷倫1290液相色譜儀，AB Science質譜儀，氮吹儀，漩渦混合儀，電子天平，冷凍離心機，超純水儀，超聲波清洗機，硅膠固相萃取柱（500 mg/3 mL）。

1.1.2 藥品與試劑

乙腈（色譜純），甲醇（色譜純），正己烷，乙醚，二氯甲烷，甲酸（色譜純）。

1.2 樣本制備

用四分法稱取適量飼料，經粉碎過40目孔篩，混勻后裝入磨口瓶中備用。

1.3 標準工作液的配制

準確稱取馬杜霉素、莫能菌素、鹽霉素和甲基鹽霉素的標準品，用甲醇分別配成1 000 μg/mL的標準儲備液，－20 ℃保存備用，有效期12個月；分別移取適量的4種1 000 μg/mL的聚醚類標準儲備液于同一容量瓶中，用甲醇稀釋成100 μg/mL混合標準液，－20 ℃保存備用，有效期6個月；再移取100 μg/mL混合標準液稀釋為 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?10 μg/mL的混合標準工作液。

1.4 樣本前處理

準確稱取試樣2.00 g（精確到0.01 g）于50 mL離心管中，加5 mL乙腈，渦旋10 min，超聲提取20 min，9 000 r/min離心5 min，取上清液轉移至另一個50 mL離心管。殘渣用5 mL乙腈重復提取一次，合并兩次上清液，取全部上清液于15 mL離心管中，40 ℃氮氣吹干，加入3 mL正己烷溶解殘渣，渦旋45 s，備用。

取硅膠固相萃取柱，加5 mL正已烷預洗，將備用液過柱，加乙醚-正己烷（體積比1∶1）10 mL，洗滌，抽干，加二氯甲烷-甲醇（體積比9∶1）5 mL洗脫，收集洗脫液，50 ℃下氮氣吹干，用乙腈（含0.1％甲酸）1.0 mL溶解殘渣，渦旋45 s后過0.22 μm濾膜，用于液相色譜-串聯質譜法（liquid chromatograph mass spectrometer / mass spectrometer，LC-MS/MS）分析。

2 ?結果與討論

2.1 標準曲線

按照農業部1862號公告-4-2012標準設置儀器參數，配制一系列濃度的標準樣本溶液（10.0 μg/kg、20.0 μg/kg、40.0 μg/kg、100 μg/kg、400 μg/kg），待儀器參數穩定后，對該系列標準樣本溶液進行測定，繪制標準曲線，馬杜霉素、莫能菌素、鹽霉素及甲基鹽霉素相關系數分別為0.999 79、0.999 71、0.998 52、0.999 38，具體見表1。

2.2 方法檢出限確定

以空白飼料樣本為基質，做7個平行添加試驗，聚醚類藥物（馬杜霉素、莫能菌素、鹽霉素、甲基鹽霉素）的陽性添加濃度均為10.0 μg/kg，按照1.4方法進行前處理，然后上機測定，測得馬杜霉素、莫能菌素、鹽霉素、甲基鹽霉素的方法檢出限（method detection limit，MDL）分別為3.58 μg/kg、 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?2.47 μg/kg、3.32 μg/kg、2.82 μg/kg，具體見表1。計算公式如下：

方法檢出限（μg/kg）＝k·Sb·C/X

式中k取3；Sb為平行測試樣含量的標準偏差；C為加標濃度（μg/kg）；X為平行測試樣含量的平均值。

2.3 回收率及精密度確定

以空白飼料樣本為基質，向飼料樣本中添加聚醚類藥物（馬杜霉素、莫能菌素、鹽霉素、甲基鹽霉素）濃度水平分別為10.0 μg/kg、20.0 μg/kg、100 μg/kg進行加標回收試驗。按照方法進行前處理，上機測試，結果如表2和表3所示。

根據表2與表3中相對標準偏差和回收率結果可發現，該方法的相對標準偏差較低，且回收率較好，馬杜霉素、莫能菌素、鹽霉素、甲基鹽霉素的回收率范圍分別為90.4％～101.5％、89.2％～102.0％、90.5％～101.0％、88.3％～103.0％，相對標準偏差分別為1.2％～1.3％、1.4％～2.2％、1.5％～3.2％、1.9％～3.8％。該方法的檢出限較低、重復性較好，并且能保持較為理想的回收率，可用于馬杜霉素、莫能菌素、鹽霉素、甲基鹽霉素的定性、定量檢測。

3 ?結論

本研究旨在建立一種飼料中聚醚類抗生素的液相色譜-串聯質譜的簡便測定方法，為相關行業檢測工作提供該類藥物的檢測方法及技術支持。結果表明，此方法前處理簡單，精密度高而且穩定性好，較大地提高了實驗整體的效率，適用于飼料中馬杜霉素、莫能菌素、鹽霉素、甲基鹽霉素殘留量的定性、定量檢測。

參考文獻

[1] 張睿，劉妤，金麗瓊，等．不同凈化方式在聚醚類抗生素殘留檢測中應用[J]．食品與發酵科技，2020，56（1）：116-119.

[2] 畢言鋒，徐倩，王樹槐，等．超高效液相色譜-串聯質譜法測定雞肉中的4種聚醚類抗球蟲藥物殘留[J]． 分析試驗室，2009，4（7）：14-21.

[3] 薄海波，雒麗麗，曹彥忠，等．超高效液相色譜-串聯質譜法測定牛奶和奶粉中6種聚醚類抗生素殘留量[J]．分析化學，2009，16（8）：1161-1166.

[4] 劉素梅，張發旺，方忠意．超高效液相色譜-串聯質譜法測定飼料中5種聚醚類抗球蟲藥的含量[J]． 中國飼料，2009，1（17）：30-32.

[5] 丁燕玲，劉國華，吳雯娟，等．超高效液相色譜-串聯質譜法測定奶粉中聚醚類抗生素殘留[J]．廣東化工，2020，47（19）：160-162.

[6] 陳明，耿志明，王冉，等．飼料中聚醚類抗生素的柱后衍生同時測定方法研究[J]．中國飼料，2005，30（20）：27-28，31.

[7] 楊露，譚會澤，劉松柏，等．禽飼料中5種聚醚類抗球蟲藥物檢測方法研究[J]．糧食與飼料工業，2021，22（1）：59-61.

[8] 賈濤．液相色譜-串聯質譜法檢測雞用飼料中聚醚類藥的方法研究[J]．飼料廣角，2016，23（2）：12-15.

[9] 劉佳佳，佘永新，劉洪斌，等．聚醚類抗生素殘留檢測技術及其研究進展[J]．食品工業科技，2011，32（8）：440-444，448.

[10] 中華人民共和國農業農村部．飼料中5種聚醚類藥物的測定 液相色譜-串聯質譜法[S]．北京：中國農業出版社，2012.