BRD4抑制劑JQ1通過超級增強子相關lncRNAs影響宮頸癌患者的預后研究*

鄭建清 黃碧芬 蘇曉寧 曾冰微

1 福建醫科大學附屬第二醫院放射治療科,福建省泉州市 362000; 2 泉州醫學高等專科學校附屬人民醫院婦產科; 3 福建醫科大學附屬第二醫院醫保辦; 4 福建醫科大學附屬第二醫院病理科

宮頸癌是全球婦女第二位常見的惡性腫瘤[1],而中國長期流行病學資料顯示,宮頸癌發病率始終高居婦科腫瘤第一位,是女性防控任務艱巨的惡性腫瘤之一[2]。盡管手術和(或)放化療對宮頸癌治療有效率高達70%～75%,仍有30%～40%轉移性宮頸癌或復發性宮頸癌缺乏有效治療手段[3-4]。近年來發現,超末端家族蛋白(Bromodomain and extraterminal domain,BET)是溴結構域蛋白(Bromine Domain Protein,BRD)核轉錄因子家族中一類全新的轉錄調控蛋白,他們可以募集多種轉錄激活子來促進轉錄激活,參與惡性腫瘤的發生發展[5]。JQ1是一種BRD4抑制劑,可以抑制BET蛋白家族的促轉錄功能,進而抑制腫瘤進展,被認為是未來治療腫瘤的潛在新藥物[6]。體內外研究表明,JQ1對宮頸癌HeLa細胞的生長具有抑制作用[7]。一些研究發現,JQ1對腫瘤相關超級增強子具有顯著抑制作用,是JQ1發揮抗腫瘤作用的重要機制之一[8],但JQ1是否參與宮頸癌HeLa細胞超級增強子的調控尚未見報道。我們的先前研究表明,JQ1對宮頸癌HeLa細胞的增殖、侵襲能力具有抑制作用[9]。為了探討JQl是否通過調控超級增強子相關lncRNA(Super enhancer-associated lncRNAs,SE-lncRNAs)表達譜發揮對宮頸癌HeLa細胞的抗腫瘤作用,本研究進一步通過全轉錄組測序,獲得了JQl處理和對照組的表達譜,并結合TCGA(The cancer genome atlas)數據庫進行預后分析,現對其結果報道如下。

1 資料與方法

1.1 Cell Counting Kit-8(CCK8)法檢測JQ1對宮頸癌HeLa細胞的最佳抑制濃度和作用時間 人宮頸癌HeLa細胞系經細胞培養合格后,采用CCK8法檢測JQ1對HeLa細胞株增殖的影響。HeLa細胞分別采用0μmol/L、0.01μmol/L、0.1μmol/L、1μmol/L濃度的JQ1處理,獲得不同JQ1濃度對HeLa細胞增殖的抑制率。具體試驗過程參照本課題前期的報道[9],JQ1處理HeLa細胞72h后,細胞增殖抑制率為(50.82±1.43)%。

1.2 全轉錄組測序及數據分析 取對數生長期的HeLa細胞接種于六孔板,細胞數目為2×105/孔,培養12h。其中3孔采用1μmol/L JQ1進行處理,設置為處理組,另外3孔不加入JQ1,設置為對照組,培養72h,按照RNA提取試劑盒的說明書提取細胞總RNA,基于NEBNext Ultra RNA庫制備試劑盒構建RNA測序文庫,使用Illumina Hiseq 4000測序平臺完成轉錄組測序。本研究測序工作由廈門生命互聯科技有限公司完成。試驗重復3次。

Illumina Hiseq 4000測序平臺獲得的FASTQ格式的原始數據,采用TopHat軟件和Cufflinks軟件處理后,獲得表達譜數據,隨后采用“limma”包進行差異表達分析,差異表達條件設置為:Log2fold change(LogFC)絕對值>1,且校正P值<0.05。

SE-lncRNAs基因目錄提取自Soibam報道的結果[10]。提取完成后,從JQ1處理組和對照組表達矩陣中提取SE-lncRNAs數據集,進行后續分析。

1.3 TCGA數據的下載與處理 在TCGA 數據庫官方網站(https://portal.gdc.cancer.gov/)下載宮頸癌表達譜和臨床信息等數據。TCGA宮頸癌序列包含組織樣本307例,正常宮頸組織樣本3例,其中隨訪時間≥1個月的宮頸資料265例。利用R4.2.0軟件及其相應R包對下載的基因表達數據進行歸一化整理,并通過log2轉化后用于后續分析。相應的宮頸癌臨床病理特征信息,僅保留生存時間、生存狀態完整的患者數據。

1.4 統計學方法 采用R 4.2.0軟件中的“survival”包、“survminer”包等進行生存分析,COX比例風險回歸模型用于評價基于表達的預后價值,Kaplan-Meier 法繪制生存曲線。以P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SE-lncRNAs篩選與差異分析結果 從全轉錄組測序中獲得基因表達矩陣,采用“biomaRt”包進行基因注釋,以表達總和超過1為基因篩選條件,通過6個樣品獲得總共3 111個lncRNAs,其中88個lncRNAs表達上調,105個lncRNAs表達下調。隨后,根據Soibam的報告[10]篩選和匹配了162個SE-lncRNA。使用校正P值(False Discovery Rate,FDR)=0.05和LogFC>1作為差異條件,共篩選出15個差異表達的SE-lncRNAs,見表1。

表1 JQ1處理后超級增強子相關lncRNA表達差異分析結果

2.2 差異表達SE-lncRNAs的預后分析 采用COX回歸分析探索差異表達SE-lncRNAs的預后價值,結果見表2。共發現4個SE-lncRNAs對宮頸癌預后具有顯著影響,分別是LINC01106、SNHG14、ITGB2-AS1、LINC02021對宮頸癌的總生存具有顯著影響(P<0.05);其中LINC01106表達增高組,患者預后較差,而SNHG14、ITGB2-AS1、LINC02021高表達組患者預后較好,差異具有統計學意義(P<0.05),見圖1。

圖1 LINC01106、SNHG14、ITGB2-AS1、LINC02021在宮頸癌中的生存曲線圖

表2 宮頸癌患者差異表達SE-lncRNAs的COX回歸分析結果

3 討論

晚期宮頸癌占全部宮頸癌患者的30%～35%,通常以全身化療為主要治療手段,但療效差,5年生存率不足35%,被認為是不可治愈[11]。盡管靶向治療或免疫治療在晚期宮頸癌患者中取得了一定效果,但與單純化療相比,其療效并未明顯提高[12]。因此,尋找針對宮頸癌的高效靶向藥物,對提高宮頸癌,特別是晚期宮頸癌患者的預后,具有重要的現實意義。

JQ1是一種分子結構與BRD4相似的小分子抑制劑,可與BRD4競爭性結合到BRD4結構域上,使BRD4的生物學被競爭性抑制,而BRD4-BRD4結構域共同參與了惡性腫瘤的生物學過程。JQ1作為單一藥物應用于某些實體惡性腫瘤具有明顯的抑制作用,提示JQ1在抗腫瘤應用領域具有廣闊前景[5-6,13]。我們前期研究表明,JQ1對宮頸癌HeLa細胞具有明顯抑制作用,說明JQ1對宮頸癌亦能發揮抗腫瘤作用,但我們的前期研究尚未深入涉足JQ1對宮頸癌的抗癌機制探索[9]。在本次報告中,我們通過轉錄組測序,進一步從基因表達層面對JQ1干擾HeLa細胞增殖的機制進行分析,為揭示JQ1的抗癌機制提供理論基礎。

本研究聚焦于超級增強子相關lncRNAs的差異性表達在宮頸癌中的預后價值。2013年,Richard等人首次提出了超級增強子(super-enhancers,SE)的概念[14],隨后Soibam提出并鑒定出了超級增強子相關lncRNAs[10]。SE-lncRNAs屬于長非編碼RNA(lncRNAs)的一個亞組,其異常表達已在多種腫瘤中被報道。然而,超級增強子介導SE-lncRNAs參與癌癥發生、發展的具體機制仍然不清楚,目前認為,超級增強子通過募集轉錄子,強化了SE-lncRNAs的表達,并通過下游基因發揮腫瘤調控作用[5]。在本研究中,我們鑒定出15個與JQ1處理有關的差異表達的SE-lncRNAs,提示SE-lncRNAs表達譜的改變,是JQ1發揮抗癌作用的重要機制。我們進一步結合TCGA數據庫,分析了差異表達SE-lncRNAs在宮頸癌中的預后價值。我們共發現4個SE-lncRNAs對宮頸癌預后具有顯著影響,分別是LINC01106、SNHG14、ITGB2-AS1、LINC02021對宮頸癌的總生存具有顯著影響(P<0.05)。LINC01106已被證明是一種促癌因子,其表達水平增高與直腸癌預后變差有關[15]。我們的轉錄組測序表明,JQ1抑制了LINC01106的表達,這與TCGA數據分析結果相符,我們的研究為未來探討LINC01106作為JQ1靶點提供了思路。SNHG14已被發現對子宮內膜癌的預后有顯著影響[16]。ITGB2-AS1被發現可以促進透明細胞腎細胞癌的進展[17]。而LINC02021在腫瘤中的具體機制與表現尚未見表達,未來可以通過該基因作為切入點,探討其在宮頸癌等惡性腫瘤中的價值。

綜上所述,JQ1具有顯著抑制HeLa細胞增殖的能力。JQ1可能通過改變超級增強子相關lncRNAs的表達譜,進而影響宮頸癌的總生存。SNHG14、ITGB2-AS1、LINC02021、LINC01106等基因的不同表達狀態,對宮頸癌的預后具有顯著影響,但其具體機制,還需要未來開展實驗研究進一步探索。