當歸多糖對多囊卵巢綜合征大鼠氧化應激狀態改善的機制

鈕紅麗,翟一陽,王 莉,馬志賓,周曉景

1.河南大學附屬南陽市第一人民醫院生殖中心,南陽 473000;2.洛陽市中心醫院生殖醫學科,洛陽 471000

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome, PCOS)是臨床常見的內分泌紊亂疾病[1]。PCOS易引發胰島素抵抗、血脂代謝紊亂、糖尿病等疾病[2]。目前PCOS臨床治療多以服用激素類藥物為主,存在服用周期長、毒性和不良反應多等缺點[3]。當歸多糖(Angelicasinensispolysaccharide, ASP)具有抗氧自由基損傷、抗炎、降糖、降脂、補血、活血等藥理作用[4]。研究表明ASP可通過減輕氧化應激反應緩解PCOS患者的癥狀[5]。本研究通過建立PCOS大鼠模型,探討ASP對PCOS大鼠氧化應激狀態的改善作用及可能的作用機制,旨在為ASP藥物的開發及PCOS的臨床治療提供參考依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器

BX53全自動顯微鏡掃描系統(日本Olympus公司);組織切片機(RM2235,德國LEICA公司);垂直電泳儀(Bio-rad1658001,美國Bio-Rad公司)。

1.2 試藥

當歸多糖(質量分數≥98%,貨號為Y11898,西安金萃坊植物技術開發有限公司);來曲唑片(國藥準字H203428,海南錦瑞制藥有限公司);二甲雙胍(常州制藥廠有限公司);雌二醇(estradiol, E2)、促黃體生成素(luteinizing hormone, LH)、睪酮(testosterone, T)、促卵泡生成素(follicle stimulating hormone, FSH)、酶聯免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assy,ELISA)試劑盒均購自北京雅安達生物科技有限公司;丙二醛(malondialdehyde, MDA)、超氧化物岐化酶(superoxide dismutase, SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)ELISA試劑盒均購自南京建成生物工程研究所;抗β-actin兔多克隆抗體、兔抗核因子E2相關因子2(nuclearfactor erythroidderived 2-like 2,Nrf2)、血紅素加氧酶1(heme oxygenase-1,HO-1)單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記二抗均購自北京百奧萊博科技有限公司。

1.3 實驗動物

60只7周齡SPF級雌性SD大鼠,合格證號為SCXK(京)2016-0011,購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。體質量約為(210±20) g,清潔級飼養,環境溫度為(23 ℃±2 ℃),環境相對濕度為55%～65%,環境光暗周期為晝12 h、夜12 h,通風良好,所有大鼠共同進行7 d的適應性飼養,期間提供充足的飲水和普通飼料,飼養環境符合實驗動物環境設施要求。

2 方法

2.1 PCOS大鼠模型的建立

7 d適應性飼養后,隨機選取48只大鼠每天上午同一時間灌胃給藥0.5 mg·kg-1來曲唑溶液建立PCOS模型[6],連續給藥21 d。造模第11天開始同一時間進行陰道細胞涂片,對比動情周期變化。大鼠動情周期平均為5 d,不在此范圍則視為動情周期紊亂,模型組大鼠動情周期全部無規律則視為建模成功[7]。

2.2 分組與給藥

將造模成功的大鼠隨機分為模型組、ASP低劑量組、ASP高劑量組和西藥組,各12只;其余大鼠作為對照組(12只)。參照文獻中的方法[8-9],ASP低劑量和高劑量組分別灌胃給藥50、200 mg·kg-1ASP(用生理鹽水配制),西藥組灌胃給藥200 mg·kg-1二甲雙胍溶液,對照組及模型組給予等量生理鹽水,各組給藥每日1次,連續給藥28 d。

2.3 標本采集

末次給藥后,所有大鼠禁食、不禁水,24 h后腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉,摘取眼球取血,靜置30 min,4 ℃下以3 000 r·min-1高速離心15 min,離心半徑為12 cm,分離血清,-20 ℃保存。采血完畢,斷頭法處死大鼠。開腹采集雙側卵巢組織,分離表面脂肪與肌肉組織,稱取卵巢的質量并測量卵巢的長度、寬度、厚度,計算卵巢體積(卵巢體積=0.52×卵巢長度×卵巢寬度×卵巢厚度,單位為mm3),一側卵巢組織于4 g·mL-1多聚甲醛液中固定24 h備用,另一側卵巢組織于-80 ℃保存,備用。

2.4 血清性激素水平測定

取出ELISA試劑盒,試劑盒放至室溫后按照試劑盒說明書配制洗滌劑、顯色劑、稀釋劑、對照品等。按照E2、FSH、LH及AMH試劑盒說明書操作,取出試劑盒中的96孔板,每孔加入工作稀釋劑50 μL,將不同質量濃度的對照品稀釋液50 μL加入各微孔中,孵育120 min,用400 μL洗滌劑清洗微孔。將酶標測試抗體100 μL加入各微孔中,室溫覆膜孵育120 min,用400 μL洗滌劑清洗微孔。加入顯色劑100 μL,室溫避光孵育30 min。將終止液100 μL加入各微孔中,終止反應。用酶標儀在412 nm波長處測量各孔的吸光度(A)值。以對照品質量濃度和A值建立標準曲線,根據標準曲線計算樣本的質量濃度。

2.5 血清氧化應激因子水平測定

將ELISA試劑盒平衡溫度至室溫后開始檢測,按照試劑盒說明書操作,用96孔板合理規劃空白組、樣品組、標準組,先于各微孔中加入基液20 μL,于各測定組微孔中加入待測樣品5 μL,對照品微孔中加入不同質量濃度對照品稀釋液5 μL,用移液槍反復吹打混勻,37 ℃恒溫孵育30 min,洗滌劑清洗微孔。再將顯色液20 μL加入各微孔中,37 ℃恒溫水浴箱孵育20 min,用洗滌劑清洗微孔。將終止液50 μL加入各微孔中,待反應完全后用酶標儀在510 nm處測定A值,根據對照品質量濃度及其A值導出標準曲線,結合待測樣品A值結果計算樣品的質量濃度并做好記錄。

2.6 HE染色觀察

取出已固定的卵巢組織,用梯度體積分數乙醇溶液脫水,二甲苯∶乙醇(1∶1)透明60 min,透明后浸入石蠟中,再把組織放入裝有石蠟的包埋盒中,于冷卻臺上進行冷卻,待石蠟完全凝固,用切片機切成厚5 μm的薄片,貼于處理后的載玻片上,置于37 ℃恒溫箱中過夜,將切片再次用二甲苯、梯度體積分數乙醇溶液進行脫蠟復水。滴加蘇木精染色液浸染3 min,流水沖洗4 min去除多余染劑,吸取伊紅乙醇溶液復染30 s,流水沖洗4 min,脫水透明,吸取中性樹膠滴于組織處,平整按壓蓋玻片以避免氣泡產生,封存固定,最后將切片置于光學顯微鏡下,觀察卵巢組織的病理變化并拍照。

2.7 Nrf2、HO-1 mRNA的表達水平

取出冷凍備用的卵巢組織,解凍后剪碎,置于EP管中,加入TRIzoL 500 μL,反應后移入研磨管內充分研磨,勻漿液裂解后在4 ℃以12 000 r·min-1高速離心10 min,吸取上清液,加入氯仿,離心后加入異丙醇,得到的沉淀即為粗純度RNA,將質量濃度測定合格的RNA樣品定容至統一質量濃度。用反轉錄試劑盒逆轉錄得到cDNA。構建PCR反應體系,Mix Ex Taq 10 μL,上、下游引物各1 μL,cDNA 1 μL,RNase free-ddH2O 7 μL。引物序列:Nrf2上游(5′-TACCGTAGGTCAGCACCAGA-3′),下游(5′-GTTTGGGAATGTGGGCAACC-3′);HO-1上游(5′-CAGATCACATGCCTTTGCCG-3′),下游(5′-TGGTTCTGCTTTGGGGTGTT-3′);β-actin上游(5′-GTGACGTTGACATCCGTAAAGA-3′),下游(5′-GCCGGACTCATCGTACTCC-3′)。循環參數:95 ℃變性反應15 s,60 ℃持續退火15 s,72 ℃ 30 s進行延伸,40個循環。分析模式為定量分析,生成擴增曲線和熔解曲線,用2-△△CT法計算目的基因相對于內參的表達量。

2.8 Western blotting檢測Nrf2、HO-1蛋白的表達水平

取適量卵巢組織剪碎,用細胞裂解液提取總蛋白,在4 ℃以12 000 r·min-1離心15 min,離心半徑為12 cm,取上清液用BCA法檢測總蛋白質量濃度,加入3×蛋白上樣緩沖液,沸水加熱5 min使蛋白完全變性,冷卻制成加樣液。配制好預制膠,拔出梳子加至電泳槽,將Marker和待測蛋白樣品100 μL加入上樣孔中,恒壓150 V電泳60 min即停止。于220 mA、45 min內轉至浸泡好的PDVF膜,再浸入脫脂奶粉于搖床上封閉2 h,將目的蛋白一抗按1∶1 000稀釋,加入稀釋一抗,4 ℃過夜,TBST漂洗3次。再加入1∶2 000稀釋二抗,孵育2 h,回收二抗,TBST漂洗3次。滴加ECL發光液,放入發光成像儀中顯影曝光,觀察條帶的灰度值,并計算目的蛋白的表達量。

2.9 統計學方法

3 結果

3.1 血清性激素水平比較

與對照組比較,模型組大鼠血清E2和FSH水平降低,T和LH水平升高(P<0.05)。與模型組比較,3個給藥組大鼠血清E2和FSH水平升高,T和LH水平下降(P<0.05)。與ASP低劑量組比較,ASP高劑量組和西藥組大鼠血清E2和FSH水平升高,T和LH水平下降(P<0.05)。ASP高劑量組血清E2、FSH、T和LH水平與西藥組比較,差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

3.2 血清氧化應激水平比較

與對照組比較,模型組大鼠血清MDA水平升高,GSH-Px和SOD水平降低(P<0.05)。與模型組比較,3個給藥組大鼠血清MDA水平降低,GSH-Px和SOD水平升高(P<0.05)。與ASP低劑量組比較,ASP高劑量組和西藥組大鼠血清MDA水平降低,GSH-Px和SOD水平升高(P<0.05);ASP高劑量組與西藥組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組大鼠氧化應激因子水平的比較

3.3 卵巢質量與體積比較

與對照組比較,模型組大鼠卵巢質量和卵巢體積增大(P<0.05)。與模型組比較,3個給藥組大鼠卵巢質量和卵巢體積減小(P<0.05)。與ASP低劑量組比較,ASP高劑量組和西藥組大鼠的卵巢質量和卵巢體積減小(P<0.05),2組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 各組大鼠卵巢質量與體積的比較

3.4 卵巢組織染色比較

對照組大鼠卵巢組織結構完整,各級卵泡和黃體清晰可見,發育形態正常;可見多層顆粒細胞排列緊密,無水腫和炎性細胞浸潤現象。模型組大鼠卵巢組織囊泡明顯擴張,各級卵泡和黃體數量減少,發育形態異常;顆粒細胞層數明顯減少且排列松散、紊亂,存在大量炎性細胞浸潤現象。與模型組比較,3個給藥組大鼠卵巢組織囊性擴張現象明顯改善,可見各級卵泡和黃體,顆粒細胞層數增加且排列緊密,炎性細胞浸潤現象明顯減少。見圖1。

注: A.對照組;B.模型組;C.ASP低劑量組;D.ASP高劑量組;E.西藥組。

3.5 Nrf2、HO-1 mRNA水平比較

與對照組比較,模型組卵巢組織Nrf2和HO-1 mRNA的表達水平下降(P<0.05)。與模型組比較,3個給藥組卵巢組織Nrf2和HO-1 mRNA的表達水平升高(P<0.05)。與ASP低劑量組比較,ASP高劑量組和西藥組大鼠卵巢組織Nrf2和HO-1 mRNA的表達水平升高(P<0.05),ASP高劑量組與西藥組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表4。

表4 各組大鼠卵巢組織Nrf2、HO-1 mRNA水平的比較

3.6 Nrf2、HO-1蛋白水平比較

與對照組比較,模型組卵巢組織Nrf2和HO-1蛋白的表達水平下降(P<0.05);與模型組比較,3個給藥組卵巢組織Nrf2和HO-1蛋白的表達水平升高(P<0.05);與ASP低劑量組比較,ASP高劑量組和西藥組大鼠卵巢組織Nrf2和HO-1蛋白表達水平升高(P<0.05),后兩組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表5、圖2。

注:A.對照組;B.模型組;C.ASP低劑量組;D.ASP高劑量組;E.西藥組。

表5 各組大鼠卵巢組織Nrf2、HO-1蛋白水平的比較

4 討論

PCOS患者機體對胰島素的敏感性低,使胰島素促進葡萄糖攝取和利用的作用無法發揮,機體代償性分泌過多胰島素,以致垂體胰島素受體釋放過多LH,促進T分泌,引起性激素水平紊亂[10-11]。治療時首選激素藥物,提高患者排卵后孕激素水平、改善黃體功能,但對卵巢功能修復效果不佳[12]。PCOS患者存在生殖障礙,不易受孕,雖然可通過促進排卵和調節激素水平增加受孕機會,但是卵巢功能差、囊性擴張仍會使患者流產風險遠高于正常孕婦[13-14]。ASP是從當歸干燥根中提取的水溶性成分,能通過質量濃度依賴方式改善氧化損傷[15-16]。本研究用來曲唑灌胃建立PCOS大鼠模型,從分子機制上探討ASP對PCOS大鼠氧化應激反應和卵巢功能的修復作用。結果顯示,模型組大鼠血清E2、FSH、GSH-Px和SOD的水平降低,T、LH和MDA的水平升高,表明模型組大鼠PCOS模型建立成功,出現明顯性激素紊亂、代謝受到影響且處于氧化應激狀態。給予不同劑量ASP和西藥的大鼠血清E2、FSH、GSH-Px和SOD水平均升高,T、LH和MDA水平降低,表明ASP可以改善PCOS大鼠性激素水平,降低體內氧化應激反應。另外,ASP各劑量組和西藥組大鼠卵巢組織HE染色結果也表明,大鼠卵巢囊樣擴張現象得到改善,間質水腫和炎性細胞浸潤現象減少。

HO-1是細胞Ⅱ期酶家族成員之一,在維持細胞氧化還原穩態、對抗由過氧化產生的活性氧自由基中發揮著重要作用[17-18]。Nrf2可調節Ⅱ期酶上游活性轉錄因子,正常情況下,Nrf2與ECH-1蛋白穩固結合而失去活性,受到機體氧化應激刺激時,Nrf2與ECH-1蛋白分離并通過調控HO-1提高機體內抗氧化酶活性,減輕機體氧化損傷,因此,Nrf2/HO-1信號通路是調控氧化應激損傷的重要通路[19-20]。在本研究中,與模型組比較,ASP各劑量組和西藥組大鼠卵巢組織Nrf2和HO-1 mRNA蛋白的表達水平升高,卵巢質量和卵巢體積均減小,結合氧化因子水平變化,表明ASP可以有效減輕氧化應激反應,可能與激活Nrf2/HO-1信號通路有關。

綜上所述,ASP能夠調整PCOS大鼠血清氧化因子水平,減輕氧化應激反應,改善卵巢囊樣擴張,可能是通過激活Nrf2/HO-1信號通路發揮作用的,可為臨床治療PCOS提供實驗依據。