苦碟子總黃酮影響心肌梗死大鼠心功能的作用機制

高麗華,孫玉艷,楊 然

1.滄州市人民醫院心血管內科,滄州 061000;2.開灤總醫院心內科,唐山 063000;3.開灤總醫院藥劑科,唐山 063000

心肌梗死(myocardial infarction, MI)由冠狀動脈供血與心肌需求失衡導致,急性期死亡風險高,慢性期以心室重構和心力衰竭為特征[1]。研究表明,氧化應激是導致MI病理損傷的機制之一[2],磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)作為細胞內能量傳感器蛋白激酶級聯反應的下游靶標,可激活抗氧化防御系統[3],叉頭框蛋白O1(fork head box protein O1,FOXO1)是一種重要的代謝轉錄因子,參與細胞的保護,使其免受過量活性氧(reactive oxygen species, ROS)的損傷,在氧化應激期間上調抗氧化水平[4]。苦碟子總黃酮(total flavonoids ofSowthistleleafixerisseedling,TFS)為抱莖苦荬菜的有效成分,對心肌缺血性損傷具有抑制作用[5]。本研究擬通過構建MI大鼠模型,并以脂溶性抗氧化劑輔酶Q10[6]作為陽性對照,探討TFS對MI大鼠心功能的保護作用及可能的機制,以期為MI的藥物治療提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

iMagic-M7型全自動生化分析儀(深圳市美思康電子有限公司);Vevo?3100型超高分辨率小動物超聲影像系統(加拿大Visual Sonics公司);Multiscan GO多功能酶標儀(美國賽默飛世爾公司);化學發光FluorChem?HD2凝膠成像系統(美國Alpha公司)。

1.2 試藥

TFS(質量分數≥90%,吉林省通化華夏藥業股份有限公司);輔酶Q10膠囊(規格為10 mg,上海上藥信誼藥廠有限公司);白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6,南京建成生物科技研究所);谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)、丙二醛(malon-dialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)試劑盒均購自南京森貝伽生物科技有限公司;兔抗AMPK、兔抗FOXO1和兔抗磷酸化FOXO1(p-FOXO1)抗體均購自美國Abcam公司;兔抗磷酸化AMPK(p-AMPK)抗體(上海碧云天生物科技有限公司)。

1.3 動物

SPF級6周齡雄性Wistar大鼠85只,體質量(200±20) g,由長沙市天勤生物技術有限公司提供,許可證號SCXK(湘)2019-0013。

2 方法

2.1 分組及給藥

將大鼠置于恒溫(22±2) ℃、恒濕(55%±5%)條件下普通飼養,12 h光-暗循環適應1周后,隨機選擇15只大鼠作為假手術組,剩余70只用于構建MI大鼠模型:腹腔注射質量濃度為10 g·L-1的戊巴比妥鈉(30 mg·kg-1)誘導麻醉并機械通氣,用加熱墊維持大鼠的正常體溫,于第3、4肋骨間打開左側胸腔,在肺動脈出口及左心房之間用6-0單尼龍線結扎左冠狀動脈,心肌組織由紅變白、脈搏減弱且心電圖ST段抬高表明冠狀動脈閉塞[7]。假手術組穿線后不結扎,其他操作與造模步驟一致。成功造模62只大鼠,隨機剔除2只,將剩余大鼠隨機分為模型組、TFS低劑量組、TFS高劑量組和輔酶Q10組,每組15只,術后48 h后給藥。TFS低、高劑量組和輔酶Q10組[8]灌服給藥劑量分別為5、10、30 mg·kg-1·d-1,假手術組與模型組大鼠均灌服等量生理鹽水,連續給藥28 d。

2.2 大鼠心臟血流動力學參數檢測

末次給藥結束后,腹腔注射30 mg·kg-1戊巴比妥鈉麻醉,大鼠仰臥,鈍性分離頸前肌以暴露右頸動脈,將壓力傳感器連接到BL-420F型生物功能實驗系統,將浸有肝素的硬膜外導管經動脈壁切口插入并緩慢推向心臟,當舒張壓突然下降到0 mmHg左右時,表明導管進入左心室;固定導管并記錄左心室收縮壓(left ventricular systolic pressure, LVSP)、左心室舒張末期壓(left ventricular end-diastolic pressure,LVEDP)、左心室壓最大增率(maximum rate of increase of left ventricular internal pressure,+dp/dtmax)和左心室壓最大減率(maximum decrease rate of left ventricular internal pressure,-dp/dtmax)[9]。

2.3 樣品采集與處理

將大鼠麻醉后稱質量,心臟取血,以3 500 r·min-1、4 ℃離心10 min,收集血清,保存于-80 ℃用于檢測血清乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)、肌鈣蛋白T(troponin T,TnT)水平和肌酸激酶MB(creatine kinase MB,CK-MB)活性;采集血樣后,脫頸處死大鼠,取出完整心臟用于TTC染色(n=7);分離左心室(包括室間隔),稱質量;收集大鼠左心室結扎處下方的心肌組織并用預冷的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline, PBS)洗去多余血液,分別保存于質量濃度為40 g·L-1的多聚甲醛和-80 ℃低溫冰箱中,用于蘇木精-伊紅染色法(hematoxylin-eosin staining, HE染色法)、酶聯免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbnent assay, ELISA)和免疫吸附試驗(Western blotting)檢測。

2.4 計算LVM/BM值

以左心室質量(left ventricular mass,LVM)/體質量(body mass,BM)值評估心肌重塑情況。

2.5 TTC染色檢測心肌梗死面積

新鮮心臟于-20 ℃放置10 min后制備成厚4 mm的組織切片,立即全部置于用37 ℃ PBS配制的TTC染液中,溫浴15 min后取出(梗死區域為白色),洗滌3次后拍照,用Image-Pro Plus 6.0軟件計算心肌梗死面積。心肌梗死面積百分比=(梗死面積/總面積)×100%。

2.6 HE染色觀察心肌組織結構

將心肌組織置于多聚甲醛中固定過夜,常規石蠟包埋并制備成厚4 μm的組織切片,二甲苯脫蠟,梯度乙醇水化,蘇木素染核3 min,鹽酸乙醇分化10 s,氨水返藍,流水沖洗后滴加伊紅染色30 s,后經梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片后,置于光學顯微鏡下觀察。

2.7 ELISA檢測炎癥及氧化應激指標

取心肌組織100 mg置于0.5 mL生理鹽水中充分勻漿,以12 000 r·min-1離心10 min,取上清。設置對照品孔、樣本孔和空白孔,分別將樣品及對照品液加入相應的檢測孔內,抗體包被,洗板,加入酶結合物工作液,洗板,加入顯色工作液,加入終止液終止反應,于450 nm波長處測定各孔的吸光度(A)值,以對照品質量濃度作為橫坐標、對應的A值作為縱坐標,繪制對照品線性回歸曲線,計算IL-6、TNF-α和MDA的含量及SOD和GSH-Px的活性。

2.8 檢測心肌AMPK/FOXO1軸蛋白的表達水平

取心肌組織,置于研缽內碾碎,移至預冷裂解液中裂解,以12 000 r·min-1離心10 min,取上清。測定蛋白濃度后加熱,使蛋白變性,SDS-PAGE凝膠電泳(濃縮膠60 V,25 min;分離膠120 V,65 min),轉膜(200 mA,120 min),質量濃度0.05 mg·mL-1脫脂牛乳封閉PVDF膜,一抗(1∶1 000)4 ℃孵育15 h;1×TBST洗膜30 min,二抗(1∶8 000)室溫孵育2 h,1×TBST洗膜30 min,ECL試劑與PVDF膜反應2 min,曝光后用Image J軟件分析條帶的灰度值,以β-actin為內參。目的蛋白的相對表達水平=目的蛋白條帶的灰度值/β-actin條帶的灰度值。

2.9 統計學方法

3 結果

3.1 LVM/BM值

5組大鼠LVM/BM值比較差異具有統計學意義(P<0.05)。與假手術組比較,模型組的LVM/BM值升高(P<0.05);與模型組比較,3個給藥組的LVM/BM值降低(P<0.05);與TFS低劑量組比較,TFS高劑量組和輔酶Q10組的LVM/BM值降低(P<0.05),輔酶Q10組的LVM/BM值最低(P<0.05)。結果見表1。

表1 各組大鼠LVM/BM值的比較

3.2 大鼠心臟血流動力學參數變化

5組大鼠LVSP、LVEDP、+dp/dtmax和-dp/dtmax比較差異具有統計學意義(P<0.05)。與假手術組比較,模型組大鼠的LVSP、+dp/dtmax和-dp/dtmax均降低,LVEDP升高(P<0.05);與模型組比較,3個給藥組大鼠的LVSP、+dp/dtmax和-dp/dtmax均升高,LVEDP降低(P<0.05);與TFS低劑量組比較,其他2組大鼠的LVSP、+dp/dtmax和-dp/dtmax均升高,LVEDP降低(P<0.05),輔酶Q10組的變化更明顯(P<0.05)。結果見表2。

表2 各組大鼠心臟血流動力學參數變化的比較

3.3 大鼠心肌組織梗死面積

TTC染色結果顯示,假手術組大鼠心肌組織呈均勻的玫瑰紅色,模型組大鼠的心肌可見明顯大范圍的白色梗死灶,3個給藥組心肌白色梗死區域均有縮小,4組大鼠心肌梗死面積比較差異具有統計學意義(P<0.05)。與模型組比較,3個給藥組大鼠心肌的梗死面積縮小(P<0.05);與TFS低劑量組比較,TFS高劑量組和輔酶Q10組大鼠心肌梗死的面積縮小(P<0.05),輔酶Q10組最小(P<0.05)。結果見圖1、表3。

圖1 各組大鼠心臟組織梗死范圍觀察

表3 各組大鼠心肌梗死情況的比較

3.4 大鼠心肌組織形態變化

HE染色結果顯示,假手術組大鼠心臟的組織結構完整,心肌細胞排列規則、整齊;與假手術組比較,模型組大鼠的心肌細胞連接松散,排列紊亂,間質炎性滲出明顯增多;與模型組比較,TFS低、高劑量組和輔酶Q10組大鼠心肌細胞的形態逐漸規則,結構逐漸完整,細胞排列逐漸有層次,炎性浸潤逐漸減輕。結果見圖2。

圖2 各組大鼠心臟組織HE染色結果 (×400)

3.5 大鼠血清心肌損傷指標

生化分析結果顯示,5組大鼠LDH、TnT水平和CK-MB活性比較差異均有統計學意義(P<0.05)。與假手術組比較,模型組大鼠LDH、TnT的水平和CK-MB的活性升高(P<0.05);與模型組比較,3個給藥組LDH、TnT的水平和CK-MB的活性降低(P<0.05);與TFS低劑量組比較,TFS高劑量組和輔酶Q10組LDH、TnT的水平和CK-MB的活性降低(P<0.05),輔酶Q10組最低(P<0.05)。結果見表4。

表4 各組大鼠血清LDH、TnT水平和CK-MB活性的比較

3.6 心肌組織炎癥及氧化應激指標因子水平

ELISA結果顯示,5組大鼠心肌組織IL-6、TNF-α、MDA含量及SOD和GSH-Px活性比較差異均有統計學意義(P<0.05)。與假手術組比較,模型組大鼠心肌組織IL-6、TNF-α、MDA的含量增加,SOD和GSH-Px的活性降低(P<0.05);與模型組比較,3個給藥組IL-6、TNF-α、MDA的含量降低,SOD和GSH-Px的活性升高(P<0.05);與TFS低劑量組比較,TFS高劑量組和輔酶Q10組心肌組織IL-6、TNF-α、MDA的含量降低,SOD和GSH-Px的活性升高(P<0.05),且輔酶Q10組的變化最明顯(P<0.05)。結果見表5。

表5 各組大鼠心肌組織IL-6、TNF-α、MDA含量及SOD和GSH-Px活性的比較

3.7 大鼠心肌組織中AMPK、FOXO1蛋白及磷酸化蛋白的相對表達水平

Western blotting結果顯示,5組大鼠心肌組織中AMPK蛋白相對表達水平比較差異無統計學意義(P>0.05),p-AMPK、p-FOXO1和FOXO1蛋白相對表達水平比較差異均有統計學意義(P<0.05)。與假手術組比較,模型組p-FOXO1蛋白的相對表達水平升高,p-AMPK和FOXO1蛋白的相對表達水平降低(P<0.05);與模型組比較,3個給藥組p-FOXO1蛋白的相對表達水平降低,p-AMPK和FOXO1蛋白的相對表達水平升高(P<0.05);與TFS低劑量組比較,TFS高劑量組和輔酶Q10組大鼠心肌組織中p-FOXO1蛋白的相對表達水平降低,p-AMPK和FOXO1蛋白的相對表達水平升高(P<0.05),輔酶Q10組的變化最明顯(P<0.05)。結果見表6、圖3。

表6 各組大鼠心肌組織AMPK、p-AMPK、FOXO1、p-FOXO1蛋白表達水平的比較

4 討論

本研究通過結扎大鼠心臟左冠狀動脈降支構建MI大鼠模型。當大鼠出現脈搏減弱、心電圖ST段抬高、心肌組織有明顯大范圍梗死且組織結構發生病理改變時,表明建模成功。模型大鼠出現LVM/BM值顯著升高,表明心室壁增厚,提示MI大鼠可能發生了左心室重構[10]。經低、高劑量TFS干預后,模型大鼠心肌組織的結構異常有所改善,心肌梗死面積顯著縮小,LVM/BM值顯著降低,表明TFS可能通過改善MI大鼠的心肌病理損傷減輕心室重構。

心臟缺血期間增加的ROS可導致細胞膜破損、脂質過氧化物產生及抗氧化防御系統破壞,當心肌膜失去完整性時,LDH和CK-MB從受損組織擴散到血液中,為心肌組織損傷的診斷標志物[11],TnT是心肌特有的收縮蛋白,是心肌功能障礙的重要生物標志物,尤其是在MI中[12]。本研究結果顯示,模型組大鼠血清LDH、TnT的水平及CK-MB的活性顯著升高,表明MI大鼠心肌細胞損傷并發功能障礙。心臟血流動力學參數可以直接反映整個心動周期左心室的壓力變化,常用于評價左心室的收縮和舒張功能[13]。LVEDP是反映左心室前負荷的指標,其與心室收縮前的回血量和心臟射血功能有關。+dp/dt受心臟后負荷和心肌收縮力的影響,是評價心肌收縮力的重要指標。-dp/dt主要受心肌舒張前負荷的影響。當心肌收縮和舒張功能受到抑制時,±dp/dt、LVSP降低,LVEDP上升[14]。本研究結果顯示,模型組大鼠LVSP、±dp/dt顯著降低,LVEDP顯著升高,表明MI大鼠心肌收縮及舒張功能受損;而經低、高劑量FPS治療后,模型大鼠的血清LDH、TnT水平及CK-MB活性顯著降低,LVSP、±dp/dt顯著升高,LVEDP顯著降低,表明FPS可能通過改善MI大鼠心肌組織損傷減輕心室重構進而促進心肌收縮及舒張功能的恢復。

氧化應激是MI的主要決定因素,其首先影響梗死的心肌,其次影響未梗死的心肌,研究表明,抗氧化劑治療可抑制心肌的氧化應激,減輕心室重構和炎癥反應,IL-6、TNF-α為促炎因子,在MI中兩者的水平均升高[15]。胞膜脂質的氧化損傷由自由基引起,自由基可以產生MDA,對抗氧化損傷的防御反應主要由抗氧化酶(如GSH-Px、SOD)介導[16]。本研究結果顯示,模型組大鼠心肌組織中IL-6、TNF-α及MDA的含量均升高,GSH-Px、SOD的活性降低,表明MI大鼠心肌組織病理損傷、心功能障礙及心室重構可能與氧化應激水平增強并促進炎癥因子的表達有關;經低、高劑量的FPS治療后,可逆轉此情況,表明FPS可能通過抗氧化應激發揮一系列心功能保護作用。

AMPK是細胞能量穩態的主要調節劑,在營養缺乏或氧化應激等條件下被激活[17],由其介導的FOXO1磷酸化對于維持FOXO1的穩定性和核定位至關重要[18]。磷酸化狀態下,FOXO1不能進入細胞核,并以泛素依賴性方式在細胞質中降解,去磷酸化的FOXO1定位于細胞核并顯示出轉錄活性[19],研究發現,AMPK激活可抑制FOXO1的磷酸化,從而促進FOXO1蛋白發生核移位,提高FOXO1蛋白的活性,進而降低細胞氧化應激水平[20]。本研究結果顯示,在模型組大鼠的心肌組織中p-FOXO1蛋白的相對表達水平顯著升高,p-AMPK和FOXO1蛋白的相對表達水平顯著降低,表明MI大鼠的AMPK/FOXO1軸被抑制;而在FPS低、高劑量組大鼠的心肌組織中p-FOXO1蛋白的相對表達水平顯著降低,p-AMPK和FOXO1蛋白的相對表達水平顯著升高,表明FPS可能通過激活AMPK促進細胞質中p-FOXO1的去磷酸化并發生核移位,進而激活FOXO1蛋白的轉錄活性,從而發揮抗氧化損傷的作用。

綜上所述,FPS可改善MI大鼠心肌組織的病理損傷,降低炎癥因子的水平,減輕心室重構,改善心肌收縮及舒張功能障礙,其作用機制可能與激活AMPK/FOXO1軸、提高MI大鼠抗氧化應激水平有關。