膠質母細胞瘤相關pTERT突變的研究進展

蔣谷峰 綜述 周 杰 審校

膠質母細胞瘤（glioblastoma multiforme，GBM）在中樞神經系統腫瘤中的發病率及惡性程度最高。端粒酶是一種依賴核糖核酸的脫氧核糖核酸聚合酶，主要由兩個亞基組成，即端粒酶逆轉錄酶（telomerase reverse tranase，TERT）和RNA。TERT 是端粒酶全酶的核心催化亞基，可通過從頭合成將TTAGGG 重復序列添加到端粒上，從而對抗端粒丟失，最終使細胞無限增殖[1]。TERT 在大多數正常成人細胞中由TERT 啟動子（TERT-promoter，pTERT）的轉錄抑制而失活，但在中樞神經系統腫瘤中卻普遍活躍，尤其是GBM。pTERT 突變通過相關機制可重新激活TERT，在GBM 發生、發展中起關鍵作用。本文就GBM相關pTERT突變分子機制進行總結，并分析其在GBM 中的相關作用，為pTERT 在GBM 的診斷、預后判斷及治療上提供參考。

1 pTERT突變的發病機制

1.1 C228T和C250T突變TERT基因位于體細胞的5號染色體短臂上，由16 個外顯子和15 個內含子組成，分別為C228T 和C250T。這兩種突變是相互排斥的，任何一種突變均會增加TERT 的表達，從而增加端粒酶的活性。它們在所有亞型的膠質瘤中發生率均很高，尤其是原發性GBM，突變率達70%。這兩種突變均產生一條完全相同的堿基對序列，包含ETS 轉錄因子結合基序，可從ETS 家族招募轉錄因子。ETS 家族成員包括ETS1、ETS2、GABPA、GAB?PB、ETV1、ETV4和ETV5，其中GABPA參與TERT的轉錄激活。敲除GABPA 的基因表達顯著降低突變型啟動子的活性，卻不影響野生型啟動子的活性[2]。體外細胞培養實驗也同時表明，突變型pTERT 需要一個四聚體形成的β1L 亞型的GABPA 進行激活，而野生型pTERT不需要，因此GABPA 是GBM中TERT表達的關鍵轉錄因子。另外，pTERT 還存在其他更罕見的突變，包括C249T和C228A，但這些突變并不會產生ETS轉錄因子的結合位點。

1.2 pTERT 甲基化大多數GBM 都存在端粒酶RNA基因（telomerase RNA component，TERC）和TERT 的高表達。研究發現，TERC 和TERT 表達水平升高與兒童非腦干GBM的預后較差有關，但與成人GBM相比，兒童GBM 的pTERT 改變卻非常罕見，這可能是由于端粒酶在成年前的干細胞和祖細胞中活躍而不需要通過TERT 突變來上調端粒酶活性；此外，pTERT甲基化與兒童腦腫瘤及野生型GBM中TERT表達增加密切相關[3]。這表明某些pTERT 野生型GBM 及兒童GBM 的TERT 的上調可以用pTERT 甲基化來解釋，但這一發現與啟動子突變的典型作用相反，因為在啟動子甲基化中，甲基化通常會沉默相關基因的表達。

1.3 端粒重復序列結合因子（telomeric repeat binding factor，TRF）2-G-四鏈（pTERT）成人GBM存在非端粒的DNA 結合因子，包括TRF1、TRF2和Ras相關蛋白1，其中大部分由G-四鏈的非雙鏈結構組成。研究表明，pTERT 突變能破壞TRF2 與GBM 中pTERT的G-四鏈結合[4]，使TERT抑制解除，當加入G-四鏈體穩定配體，TRF2 結合重新獲得，并重新抑制攜帶pTERT突變的端粒酶。

1.4 pTERT 突變的時間節點研究表明，C228T 和C250T 突變可以將pTERT 的轉錄活性上調2～4 倍，而且GBM中pTERT mRNA及TERT表達水平高于正常人腦細胞，表明GBM 中pTERT 突變導致TERT 表達上調。然而，pTERT突變發生在GBM的早期還是晚期，尚不明確。雖然TERT在GBM中表達升高，但pTERT突變GBM的端粒比對照組卻更短，表明這些突變可能發生在癌變之后。Ackermann 等[5]研究表明突變在同一病人不同腫瘤病灶中高頻率出現，比較瘤周組織（腦室下區）、腫瘤組織與匹配的正常組織發現，瘤周區域早已有pTERT突變，可能是腫瘤的起源。因此GBM早期可能會通過PTEN的基因復制丟失與TERT突變共同作用進展為一種的癌變前體，最終引發GBM。

2 預后預測

2.1 pTERT單核苷酸多態性（SNPrs2853669）pTERT的單核苷酸多態性SNPrs2853669包括純合子C/C突變和野生型T/T等，通過調控其他途徑導致與預后相關。一項對126 例GBM 的研究表明，攜帶SN?Prs2853669 的pTERT 突變亞組比SNPrs2853669 非攜帶者的中位生存期更長；然而，當SNPrs2853669發生C/C 純合子變異時，尤其是在C228T 或C250T pTERT 突變存在的情況下，生存期顯著縮短[6]。這提示攜帶SNPrs2853669 可能是pTERT 突變相關GBM 的有利預后因素，而當SNPrs2853669 發生C/C純合子突變時，使ETS2 結合位點的破壞和TERT 表達降低，最終導致端粒酶活性低于野生型T/T 純合子，因此SNPrs2853669 C/C 純合子基因型可作為pTERT突變病人短期生存期的獨立預測因素。但目前仍缺乏關于SNPrs2853669 野生型純合子T/T 對pTERT 突變相關GBM 病人生存率是否有影響的研究。

2.2 pTERT 突變與其他基因關聯pTERT 突變具有獨立負性預后影響。Dono 等[7]同時觀察異檸檬酸脫氫酶（isocitrate dehydrogenase，IDH）和pTERT突變的GBM，發現即使在沒有IDH 突變的腫瘤中，GBM 的pTERT 突變也預示著低存活率，且同時攜帶pTERT突變型和IDH 野生型腫瘤的總體生存期最差。Bol?lam 等[8]發現pTERT 突變的存在不是預后不良的獨立影響因素，表現為IDH 突變型和IDH 野生型GBM無顯著差異。因此，pTERT能否作為預測GBM的預后獨立因素暫無定論。

研究表明，pTERT 突變的負面影響與共同存在的分子和臨床因素有關，如年齡、IDH-wt 狀態和未甲基化的O6-甲基鳥嘌呤DNA 甲基轉移酶（O6-methylguanine- DNA methyltransferase，MGMT）狀態。研究表明，這些因素未能觀察到與pTERT 突變的存在有統計學意義的獨立的生存關聯。劉千琪等[9]發現，pTERT 突變的存在與總體生存期無關，GBM的pTERT 突變與IDH1/2 突變同時發生的頻率較低（11.5%），同時野生型IDH1/2 聯合pTERT 突變的GBM 病人總體生存期較IDH1/2 突變聯合pTERT 突變的GBM低。此外，pTERT突變型與上皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）擴增高度相關（44.1%），且EGFRⅧ在24%～67%的GBM 中表達，當GBM 中EGFR 擴增及pTERT 突變同時存在時，病人總體生存期明顯下降。在GBM 中，pTERT突變與MGMT 啟動子甲基化同時發生的概率為43.6%，MGMT 啟動子未甲基化較低級別膠質瘤高，表明MGMT 未甲基化與pTERT 突變共存是GBM 的預后不良因素[10]。

3 輔助診斷技術

3.1 MRI 的診斷價值一項對60 例GBM 的MRI 的研究發現，GBM 未顯示TERTp-mut 與腫瘤部位相關；但對于原發性中樞神經系統淋巴瘤的MRI 分析顯示，TERTp-mut 更常累及胼胝體壓部；此外，聯合分析IDH1/2 和pTERT 突變狀態可以區分膠質病變是GBM 還是反應性膠質增生，反應性膠質增生樣本不包含pTERT區域的C228T或C250T突變[11]。

3.2 檢測pTERT 的新興技術2016 年WHO 對GBM的分類仍基于IDH，分為IDH野生型GBM、IDH突變型GBM 和未另行指定的GBM。隨后，TERTp 突變、EGFR突變和MGMTp甲基化可通過體液活檢腫瘤分子譜整合到臨床診斷中。循環腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）在血液和體液中的釋放取決于腫瘤的位置、大小和腫瘤的血管浸潤[12]，因此通過血液、腦脊液、尿液和其他體液檢測和分離循環腫瘤細胞和ctDNA，間斷分析ctDNA可提供腫瘤成分、異質性、預后生物標記物及其與其他臨床相關癌癥生物標記物的關系等信息。液體活檢中的ctDNA水平因人而異，通過間斷的ctDNA監測，同時利用液滴式數字PCR 分析檢測pTERT 突變，可評估GBM 的進展，使pTERT突變作為未來個體化診治的生物標志物成為可能。

4 靶點治療

4.1 端粒酶抑制劑由于端?？s短的生理病理機制，TERT抑制可能在經歷多個細胞周期后才發揮作用，因此限制了端粒酶抑制劑的應用。目前，這種靶向治療在癌癥中沒有得到批準。伊美司他是一種小型的TERT抑制劑，在治療原發性血小板減少癥方面顯示出明確的療效，同時在GBM 細胞系中，長期伊美司他治療可導致GBM 腫瘤起始細胞的進行性端?？s短、增殖率降低和誘導細胞死亡；另外，伊美司他聯合放療和替莫唑胺化療對GBM 細胞存活率有顯著影響[13]。然而，一項針對兒童難治性中樞神經系統腫瘤的臨床試驗，因出現治療相關的血小板減少繼發的腫瘤內出血而過被迫停止。同時，另一項臨床前研究表明，治療轉移性乳腺癌中經常使用的微管抑制劑燈盞花素作為一種微管抑制劑，也被證明對依賴TERT-RNA 的RNA 聚合酶具有特異的抑制活性[14]，可以抑制pTERT 突變的GBM 細胞系的生長，并顯著延長小鼠的生存時間，但缺乏臨床試驗。靶向GABPβ1L而非TERT本身可能是燈盞花素靶向治療TERTP 突變細胞的一種方向，且同時保留正常細胞以避免伊美司他的引起的造血功能障礙。在一項GBM 細胞系研究中，破壞β1L 亞型可以逆轉TERTp 突變的GBM 細胞的無限復制[15]。在小鼠GBM的異種移植模型中，敲除GABPβ1L會削弱腫瘤的生長并提高小鼠的存活率。此外，BIBR1532作為一種可破壞β1L 亞型有效的端粒酶抑制劑，可以通過在轉錄和翻譯水平下調端粒酶活性來誘導細胞凋亡[16]，但還沒有可用的臨床數據或臨床試驗。

4.2 TERT 活性靶向疫苗一項從自體腫瘤干細胞培養中提純的RNA 轉染的樹突狀細胞的試驗表明[17]，所有接受治療的細胞均出現了免疫反應，沒有明顯的毒性或自身免疫的跡象；接種疫苗的病人的無進展生存期明顯更長，經過2年的隨訪，7例中有5例存活。一項Ⅱ期臨床試驗表明，樹突狀細胞疫苗（den?tritic cell vaccine，DCV）沒有顯著改善43 例GBM 病人的總體生存期或無進展生存期，在調整B7-H4 的表達后，DCV 改善總體生存期，這是由于B7 分子是腫瘤微環境中重要的免疫逃逸介質，其中B7-H4 在高級別膠質瘤中高表達，可阻斷有效的T 細胞免疫反應。因此，DCV 可作為治療pTERT 突變腫瘤的GBM 的首選疫苗。同時，UCPVax 作為一種基于端粒酶衍生輔助肽的治療性抗癌疫苗，可誘導Th1CD4T 細胞的強烈反應[18]，盡管Ⅰ期試驗結果尚未公布，但這種這種疫苗被證實是安全的，未來將可能替代DCV成為治療GBM的首選活性靶向疫苗。

綜上所述，pTERT 突變作為GBM 發生、發展的最重要機制之一，對于大部分成年GBM，其可通過突變后的堿基序列招募GABPA 轉錄因子或通過破壞TRF2 與pTERT 的G-四鏈結合來激活TERT 活性，然后通過PTEN 的基因復制丟失（雜合子缺失）與TERT 突變共同作用進展為一種的癌變前體，最終引發GBM。而對于小部分的兒童GBM 及野生型GBM，其機制可能為pTERT的甲基化。其次，pTERT對于能否預測GBM病人預后，仍存在爭議。但若同時攜帶SNPrs2853669的pTERT突變的GBM，比非攜帶者的預后更好，當SNPrs2853669 發生純合子C/C突變時，存活率明顯降低。再者，當pTERT 突變同時攜帶IDH 野生型、pTERT 突變、GFR 擴增、MGMT未甲基化其中之一者，預后更差。pTERT 對于頭顱MRI的意義表現為TERTp-mut原發性中樞神經系統淋巴瘤病例更常累及胼胝體壓部，聯合分析IDH1/2狀態可以區分膠質病變是GBM 與反應性膠質增生。間斷液體活檢及液滴式數字PCR分析對個體化診療及判斷預后具有重要的意義。靶向作用于GABPβ1L 可能是燈盞花素靶向治療TERTP 突變細胞的一種方向，且同時保留正常細胞以避免伊美司他的引起的造血功能障礙，已逐漸形成取代伊美司他的趨勢。此外，BIBR1532可通過在轉錄和翻譯水平下調端粒酶活性誘導細胞凋亡達到治療效果，也將成為研究的熱點。就免疫靶向活疫苗來說，DCV可作為治療B7-H4 分子低表達的pTERT 突變腫瘤的GBM 的首選方案，而UCPVax 作為一種基于端粒酶衍生輔助肽的治療性抗癌疫苗，亦在未來有可能取代DCV。