基于國家專利數據庫和網絡藥理學探討中藥復方治療肝硬化腹水的配伍規律及作用機制*

徐 喆 周會芳 龔博煬 王 瑩 趙澤宇 邊育紅

天津中醫藥大學中西醫結合學院 (天津, 301617)

近年來,隨著人民生活水平的提高和飲食結構的改變,肝病及其相關并發癥已成為全球重大公共衛生問題[1,2]。肝硬化是各種慢性肝病的終末期發展階段之一,而腹水是肝硬化的常見并發癥,預示著肝硬化進展為失代償期,其臨床預后不佳,3年內死亡率達50%[3]。門靜脈高壓癥和鈉水潴留是腹水形成的兩個關鍵因素[4]。肝硬化腹水嚴重降低了患者的生活質量,給社會帶來沉重的經濟負擔。限鈉、利尿、大容量腹腔穿刺術和經頸靜脈肝內門體支架分流術是西醫治療肝硬化腹水的主要治療手段,但仍然存在其治療效果不理想、副作用多且容易復發等問題[5]。

中醫藥在肝硬化腹水的防治中發揮了十分重要的作用,針對肝硬化腹水病因、病機、分期進行辨證論治,從而改善臨床癥狀、提高生活質量、延長生存時間,取得了良好的療效[6]。因此,有必要運用現代研究方法,對中藥專利復方進行深入探索,研究它們之間的關聯規則和配伍規律。本研究通過挖掘國家專利數據庫中治療肝硬化腹水的中藥復方數據,分析其用藥規律和配伍特點,確定核心藥物,運用網絡藥理學篩選有效成分和治療靶點,并進行富集分析,選取主要成分與核心靶點做初步的分子對接驗證。我們探索和闡述了核心藥物治療肝硬化腹水的潛在分子機制,為其在臨床的推廣提供參考依據,為新藥研發提供思路,整體研究思路如圖1 所示。

圖1 國家專利中藥復方核心藥物治療肝硬化腹水的作用機制研究思路

1 材料與方法

1.1 復方數據來源 登錄“國家知識產權局-中國專利公布公告”網站(https：//www.cnipa.gov.cn/),進入“高級查詢”頁面,勾選“發明公布”與“發明授權”,將“肝硬化腹水AND中藥”作為“名稱”進行檢索,篩選結果后得到最終數據。檢索時間范圍為建庫至2022年3月8日。

1.2 復方納入與數據標準化 納入國家專利數據庫中治療肝硬化腹水的全部中藥復方專利;藥物組成相同但用量不同的可重復錄入,藥物組成及用量相同的僅錄入1次。排除外用復方,排除非中醫藥醫療類專利。依據2020年版《中國藥典》、《中華本草》對中藥名稱進行規范化處理;按照《中藥學》規范中藥復方的藥物功效類別。

1.3 數據關聯規則與聚類分析 利用IBM SPSS Modeler 18.0軟件,基于Apriori算法對已納入的中藥復方進行關聯規則分析,設置同時滿足最低條件支持度≥7,最小規則置信度百分比≥65,提升度>2的藥物為治療肝硬化腹水的常見藥物。利用IBM SPSS Statistics 24軟件中的組間聯接聚類算法,對高頻藥物進行聚類分析。

1.4 中藥復方專利核心藥物化學成分與作用靶點挖掘 根據頻次統計與關聯規則,確定治療核心中藥。通過TCMSP數據庫[7]挖掘核心藥物的化學成分,設置化合物生物口服利用度(OB)≥30%、類藥性指數(BL)≥0.18,篩選活性成分和蛋白靶點。此外,查閱文獻添加已報道的化學成分和蛋白靶點。使用Uniport數據庫[8]對蛋白進行名稱規范轉化操作。

1.5 肝硬化腹水潛在靶點獲取 以“cirrhosis ascites”“cirrhotic ascites”為關鍵詞分別在GeneCards 數據庫和OMIM 數據庫進行檢索,獲取肝硬化腹水相關靶點。

1.6 PPI網絡構建及核心靶點篩選 將核心藥物作用靶點和肝硬化腹水潛在靶點進行比對,得到作用靶點。將作用靶點導入String Version 11.5平臺[9],選取分值>0.9分的高置信度區間,根據自由度值≥2倍中位數的靶點構建PPI 網絡,篩選核心靶點。

1.7 核心藥物-成分-靶點-疾病網絡構建 將核心藥物、化合物成分、核心靶點、疾病信息導入Cytoscape 3.8.0軟件[10]繪制中藥-成分-靶點-疾病網絡圖。

1.8 KEGG通路和GO功能富集分析 為進一步研究核心藥物治療肝硬化腹水的作用情況,使用和Metascape平臺[11]對核心靶點進行KEGG信號通路和GO功能富集分析,結果以P值升序排列。

1.9 分子對接驗證 根據質譜結果[12-17]和Degree值選出β-谷甾醇、常春藤皂苷元、毛蕊異黃酮、丹參酮ⅡA、異鼠李素、槲皮素、兒茶素、澤瀉醇C作為核心藥物的主要成分,與核心靶點做初步的分子對接驗證。下載主要成分和靶點文件,配置Config 文件,運行Autodock vina1.1.2,計算分子對接結合能[18-20];在Open Babel GUL軟件中將pdbqt格式文件轉化為pdb格式文件,在PyMOL中打開pdb格式文件,運用PLIP網站[21]進行可視化分析。

2 結果

2.1 專利檢索統計與分析 通過檢索國家專利數據庫,共獲得專利139項,納入符合標準的共110項。110項專利涉及藥物456味,用藥頻次總計1 607次。其中使用頻率≥10次的藥物共40味,占總使用頻次的44.18%,見表1。對頻次≥10次的藥物進行功效類別分析,發現各中藥類別使用頻率排名前4位的為：補虛藥、利水滲濕藥、活血化瘀藥和理氣藥,多有補氣健脾、利水滲濕、活血利濕、調理氣機的作用,用藥特點與鼓脹的基本病機“脾氣虛弱、氣滯、血瘀、水停”相符。

表1 110付治療肝硬化腹水中藥復方專利高頻藥物(≥10次)

2.2 關聯規則與聚類分析 將40味高頻藥物導入IBM SPSS Modeler 18.0軟件中,得出專利復方治療肝硬化腹水在組方配伍時同時出現且頻率較高的藥物。關聯規則結果以“后項→前項”展示,按支持度百分比由高到低排序。

2.2.1 設定最大前項數為2,得到關聯規則89條,取前5條關聯規則進行展示,見表2。結果顯示二階關聯規則中支持度最高的為丹參-黃芪,三階關聯規則中支持度最高的為白術-黃芪-丹參。

表2 中藥復方專利治療肝硬化腹水藥物關聯分析表

2.2.2 根據數據挖掘結果,繪制高頻藥物關聯規則web可視化布局圖。通過線條粗細來表示藥物配伍關系的強弱,線條越粗,藥物之間的配伍關系越強。結果顯示,強配伍關系為白術-茯苓,見圖2。

圖2 高頻藥物關聯規則web可視化布局圖

2.2.3 運用IBM SPSS Statistics 24軟件中的組間聯接聚類算法,對上述40味高頻藥物進行聚類分析,根據結果,可將中藥組合分為6類,見圖3。

圖3 高頻藥物聚類分析樹狀圖

2.3 核心藥物作用化合物及靶點 根據頻次統計與關聯規則,確定白術、茯苓、黃芪、丹參、茵陳、大腹皮、澤瀉為核心中藥。綜合文獻報道及各數據庫檢索,化合物種類為：白術4種、茯苓13種、黃芪18種、丹參62種、茵陳11種、大腹皮3種、澤瀉9種,去除重復后獲得116個化合物,涉及作用靶點912個。

2.4 肝硬化腹水疾病潛在靶點 在GeneCards和OMIM數據庫中分別找到肝硬化腹水相關靶點2 017和99個,去除重復靶點,共得到2 048個疾病靶點。

2.5 PPI網絡構建及核心靶點篩選 將核心藥物的912個靶點與肝硬化腹水潛在靶點取交集,得到核心藥物治療肝硬化腹水的作用靶點共331個,根據自由度篩選得到61個核心作用靶點。

2.6 構建核心藥物-成分-靶點-疾病網絡 將中藥、化合物成分、核心靶點和疾病導入Cytoscape 3.8.0軟件繪制中藥-成分-靶點-疾病網絡圖。見圖4。倒三角形表示核心藥物,六邊形表示化合物成分,菱形表示核心靶點,三角形表示肝硬化腹水疾病。

圖4 核心藥物-成分-治療靶點-疾病網絡圖

2.7 KEGG通路和GO富集分析 將61個核心靶點導入Metascape平臺進行KEGG通路富集分析,得到KEGG通路總計174條。排名靠前的通路主要有癌癥相關途徑、乙型肝炎、PI3K-Akt信號通路、丙型肝炎等,按P值對排名前20的通路繪制富集分析氣泡圖,見圖5。

同時將這61個核心靶點導入Metascape平臺進行GO富集分析,獲得1 432條生物過程條目,71條細胞組分條目,105條分子功能條目。根據P值進行排序,選擇生物過程前10條、細胞組分和分子功能前5條目繪制富集分析氣泡圖,見圖6。GO富集分析可知,靶點蛋白主要參與了對生長因子的反應、蛋白質磷酸化的正調控、轉錄調節復合物、局灶性粘連、蛋白激酶活性、激酶結合等過程。

圖6 GO生物過程、細胞組分以及分子功能富集分析氣泡圖

3.8 分子對接 將核心藥物主要成分β-谷甾醇(Beta-sitosterol)、常春藤皂苷元(Hederagenin)、毛蕊異黃酮(Calycosin)、丹參酮ⅡA(Tanshinone ⅡA)、異鼠李素(Isorhamnetin)、槲皮素(Quercetin)、兒茶素(+)-Catechin、澤瀉醇C(Alisol C)與核心靶點SRC(1O43)、TP53(4CZ5)、HSP90AA1(1BYQ)、STAT3(6NJS)進行分子對接結合。一般而言,小分子配體與大分子受體結合的構象越穩定時能量越低,發生作用的可能性越大,對接結合能<-5 kcal/mol時說明可形成穩定的對接結構[22]。本研究結果顯示,八種主要成分都能與核心靶點較好的結合,其中常春藤皂苷元與核心靶點結合最好,見表3,分子對接圖見圖7。

表3 核心藥物主要成分與核心靶點對接結合能(kcal /mol)

3 討論

根據肝硬化腹水的臨床表現和病變特點,歸屬于中醫“鼓脹”范疇,其病機為肝失疏泄、脾失健運、腎失氣化,辨證分型為：氣滯水停證、脾虛水停證、濕熱水停證、血瘀水停證、脾腎陽虛水停證、肝腎陰虛水停證[6]。治療肝硬化腹水多注重病機和癥狀治療,臨床多運用白術、茯苓、黃芪、丹參、大腹皮等藥物。

本研究共納入110項治療肝硬化腹水的中藥復方專利,包含456味藥物。根據頻次統計與關聯規則,確定白術、茯苓、黃芪、丹參、茵陳、大腹皮、澤瀉為核心中藥。白術健脾益氣、燥濕利水,發揮保肝、利膽等作用[12]。茯苓健脾、利水滲濕,發揮保肝、防治肝細胞壞死等作用[13]。黃芪補氣升陽,發揮抗纖維化、保肝等作用[23]。丹參活血化瘀,具有防護肝細胞損傷、促進肝細胞再生、抗肝纖維化等作用[24]。茵陳利膽退黃,具有保肝、利膽、防治肝纖維化等作用[15]。大腹皮利水消腫、行氣寬中,能興奮胃腸道平滑肌。澤瀉利水滲濕,發揮利尿、保肝、減輕肝臟脂肪性病變等作用[17]。7味核心藥物中,白術、茯苓、黃芪、大腹皮、澤瀉以補氣健脾、利水滲濕為主,輔以丹參活血化瘀,茵陳清利濕熱。

根據高頻藥物類別分析,占據前4類的是補虛藥、利水滲濕藥、活血化瘀藥和理氣藥,這與核心藥物分布一致。在治療肝硬化腹水的專利復方中,常以補虛藥為主,利水滲濕藥、活血化瘀藥和理氣藥為輔。根據高頻藥物聚類分析共得出6個聚類組合,聚4類：柴胡、青皮、白花蛇舌草、山楂、牡丹皮、鱉甲、當歸、山藥、黃精、虎杖、豬苓、薏苡仁、茵陳、枳殼、茯苓、澤瀉、白術、黨參,可視為柴胡疏肝散、五苓散、參苓白術散化裁而來,其功擅疏肝理氣、健脾益氣、化氣利水、行水散滿,適用于肝硬化腹水氣滯水停和脾虛水停者。

分析PPI網絡可知,核心靶點包括SRC、TP53、HSP90AA1和STAT3。SRC在肝纖維化中具有重要作用,SRC抑制劑可通過阻止肝星狀細胞活化,降低結締組織生長因子來治療肝纖維化[25]。TP53是降低肝細胞癌風險的潛在候選物,其功能的喪失被認為是多階段肝癌發生中最重要的一步[26]。STAT3與肝損傷、炎癥、再生和肝細胞癌的發生發展密切相關[27,28]。不難發現,這些核心靶點主要參與肝纖維化、肝癌發生、肝損傷和肝硬化等過程,從而起到治療肝硬化腹水的作用。

根據質譜結果和Degree值篩選核心藥物的主要成分。β-谷甾醇廣泛應于與肝臟疾病,具有抗炎、降脂、防止肝組織膠原過度累積、改善肝毒性肝臟損傷作用[29]。常春藤皂苷元可抑制肝癌細胞的生長,降低血糖,降低血脂[30]。在HepG2肝癌細胞中,毛蕊異黃酮可誘導線粒體依賴性凋亡和細胞周期停滯,并通過ROS介導的信號通路抑制細胞遷移,從而抑制肝癌細胞生長[31]。丹參酮ⅡA是從丹參根中分離得到的,具有抗纖維化、抗癌、抗氧化、抗炎等作用[32]。異鼠李素是一種保護肝臟的黃酮類化合物,可通過TGF- β1/Smad3通路抑制細胞外基質形成治療肝纖維化[33]。槲皮素對各種急、慢性肝損傷均具有良好的防治作用[34]。研究表明,(+)-兒茶素和澤瀉醇C均可改善肝脂代謝紊亂和肝損傷[16,17]。

分子對接結果顯示,主要活性成分與核心靶點穩定結合,初步驗證了上述網絡藥理學預測結果的可靠性。通路富集結果顯示,核心藥物可能通過乙型肝炎、PI3K-Akt信號通路、丙型肝炎等發揮作用。其中乙型肝炎和丙型肝炎信號通路與肝病直接相關;PI3K/Akt信號通路可轉導調節細胞外基質降解、肝星狀細胞活化和肝竇毛細血管化,在肝纖維化形成中起重要作用[35]。

但本研究仍存在一定局限性,基于國家專利數據庫數據挖掘方法僅簡單地統計分析出用藥頻次,未能充分考慮中醫辨證分型的特點。獲得的關鍵蛋白靶點和信號通路,未能采用體內外實驗來驗證其預測的準確性。因此,這些局限性有待課題組進一步完善和補充。