改良抗酸染色聯合CPA 檢測技術在肺結核診斷的應用

張計超，杜 杰

（1.安陽市燈塔醫院，河南 安陽 455000；2.安陽市婦幼保健院，河南 安陽 455000）

肺結核是由結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）引起的慢性傳染病，我國患結核病人數居世界第二，防治情況仍然較為嚴重。而對于疑似病例，臨床上仍以痰涂片、結核菌素試驗（PPD）、MTB 培養為主，痰涂片簡單，但是敏感度低，PPD 存在假陰性，MTB 培養耗費時間。改良抗酸染色法是在傳統染色基礎上進行步驟的改良，能減少觀察視野，提高抗酸桿菌檢測率[1]。交叉引物核酸恒溫擴增技術（CPA）是一種新型分子診斷技術，能夠一次性完成核酸的擴增及雜交過程，具有操作方便、費用低，檢測時間短等優點[2]。因此本文采用改良抗酸染色聯合CPA 診斷疑似肺結核患者，探究其在臨床診斷中的價值，報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2018 年1 月～2019 年12 月218 例來安陽市燈塔醫院就診的疑似肺結核患者痰標本，其中男134 例，女84 例，年齡20～76 歲，平均年齡（46.13±4.35）歲。納入標準：具有疑似肺結核的臨床表現；胸部影像學檢查與活動性肺結核相似；同意留取合格的痰標本并進行檢測，且痰標本量≥2mL；患者及其家屬均自愿并簽署知情同意書。排除標準：伴有肺外結核，合并嚴重感染性疾病；已接受抗結核治療>2 周；伴有認知障礙或精神障礙。本研究經醫學倫理委員會同意。

1.2 診斷方式

痰涂片：涂片、萋尼氏抗酸染色，LED 顯微鏡鏡檢，視野下呈現紫紅色為陽性結果，操作均嚴格按照《痰涂片鏡檢標準化操作及質量保證手冊》[3]進行。羅氏培養：培養操作嚴格按照《結核病診斷實驗室檢驗規程》[4]，使用1-2 倍體積4%NaOH 溶液對痰標本進行消化、離心等處理，將沉淀物接種到酸式羅氏培養基（購自珠海貝索公司）斜面，于37℃溫箱培養，菌種鑒定結果為MTB，即視為陽性。改良抗酸染色法：取1mL 痰液，根據痰液性狀加入1～2 倍標本體積的10%NaOH 進行處理，并振蕩至其液化，將其離心15min，制片，室溫晾干，并用火焰固定，將待檢驗玻片置于玻璃槽中，加0.2%的Triton-X100，置于冰箱破膜處理30min，取出玻片，沖片（0.01mol/LPBS）后自然晾干進行抗酸染色，改良部分主要為：將切片厚度增加至6～8μm；采用汽油與松節油1：1 的混合液代替傳統的二甲苯脫蠟；染色液改良：在品紅染液中加0.1mL 吐溫；將1%濃度的鹽酸酒精改為3%[5]。陽性：MTB 表現為成堆、成束或單個的細長或直或彎的紅色桿菌，背景呈淡藍色，較清晰。CPA：痰液中加入4%NaOH，消化處理15min 后，12000r/min 離心5min，并進行95℃水浴等處理，得到上清DNA 模板。再將其加入玻璃化試劑反應管重，加入復溶緩沖液、石蠟油及雙蒸餾水，進行核酸恒溫擴增；將擴增后反應罐放入核酸檢測裝置中，進行結果判讀。陽性：質控線（C）與檢測線（T）均出現，或僅出現T 線顯色。陰性：僅出現C 線顯色；無效：T 和C 線都未出現，即無效，需查明原因并進行二次檢測。改良抗酸染色法聯合CPA：痰樣本先進行改良抗酸染色法檢測，陰性樣本再行CPA 技術檢測。

1.3 觀察指標

比較不同診斷方式的檢測結果：參照肺結核診斷標準，記錄所有標本采用5 種方式檢測的陽性數，并計算陽性率。不同診斷方式的診斷價值：以羅氏培養結果為金標準，比較不同診斷方式的敏感度、特異度、準確度、陽性預測值、陰性預測值。敏感度=真陽性例數/（真陽性例數+假陰性例數）×100%，特異度=真陰性例數/（真陰性例數+假陽性例數）×100%，準確度=（真陽性+真陰性）例數/總例數×100%，陽性預測值=真陽性例數/（真陽性例數+假陽性例數）×100%，陰性預測值=真陰性例數/（真陰性例數+假陰性例數）×100%。

1.4 統計學方法

采用SPSS20.0 統計學軟件進行統計分析，計量資料以±s表示，采用t檢驗；計數資料以率（%）表示，采用χ2檢驗，以P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同診斷方式的檢測結果比較（見表1）

表1 不同診斷方式的檢測結果比較（n，%)

2.2 不同診斷方式的診斷價值分析（見表2、3）

表2 不同診斷方式結果與羅氏培養結果比較

表3 不同診斷方式的診斷價值

3 討論

痰涂片是常用的檢測MTB 的有效手段，其對肺結核的確認、傳染源的控制及療效評估等具有重要意義，但其檢測敏感性差，對于鏡檢結果陰性疑似患者仍需進行MTB 培養并進行影像學檢查、病理學檢查等，耗時較長，影響患者疾病控制。改良抗酸染色法是在傳統抗酸染色進行了步驟改良，能保證取材，并確定濃縮標本中的有形成分，且采用Triton-X100 可有效增加細胞膜的通透性，使胞內菌體易于著色。本研究在218 例疑似肺結核患者中，改良抗酸染色法的陽性率為41.74%，高于痰涂片的陽性率；以羅氏培養結果為金標準，其敏感度、特異度分別為66.36%、83.33%，說明改良抗酸染色法對MTB 的診斷具有一定的敏感性及特異度。改良抗酸染色法經濟實用，半小時可以完成一份標本的檢測，能夠很好的利用醫療資源。

CPA 是由我國研發首個具有自主知識產權的體外核酸擴增技術，將病原體DNA 擴增、核酸雜交和核酸試紙條檢測融為一體，能夠對MTB 感染進行定性診斷，同時一次性核酸檢測裝置可減少或避免擴增產物氣溶膠對環境造成二次污染。本研究在218 例疑似肺結核患者中，CPA 的陽性率為44.95%，高于痰涂片的陽性率；以羅氏培養結果為金標準，其敏感度、特異度分別為75.45%、86.11%，說明CPA 對MTB 的診斷具有較高的敏感性。CPA 可在2h 內出結果，且對實驗室操作人員能力要求低，試劑也可常溫運輸，因此適合縣級醫院進行MTB 的檢測。而將改良抗酸染色法聯合CPA 使用在218 例疑似肺結核患者中的陽性率為47.71%，以羅氏培養結果為金標準，其敏感度、特異度為89.09%、94.44%，高于痰涂片、改良抗酸染色法及CPA，說明改良抗酸染色法聯合CPA 檢測能夠提高敏感度及特異度。我國大部分的肺結核病人多分布在農村，如何利用農村的現有醫療，快速且較準確進行診斷尤為重要。而改良抗酸染色法聯合CPA檢測不需要價格昂貴儀器設備，耗時短，使用簡單方便，有效縮短結核病人的確診時間，有利于患者的治療及治愈[5]。

綜上，采用改良抗酸染色法聯合CPA 檢測疑似肺結核患者痰樣中的MTB 具有較高的敏感度、特異度。