MiR-144-3p調控E2F8對腎透明細胞癌增殖、凋亡的影響

田 捷,余黃琴,周 敏,郭 龍,劉 飛

(1.南昌大學第二附屬醫院泌尿外科,南昌 330006; 2.九江市第一人民醫院耳鼻喉科,江西 九江 332000)

腎透明細胞癌(kidney renal clear cell carcinoma,KIRC)是腎細胞癌中最常見的病理分型,其最有效的治療方法仍是手術干預[1-2]。目前,KIRC發生發展的分子機制尚不明確,KIRC相關的基礎研究對未來KIRC的臨床診療水平的進步有重要意義。微小RNA(miRNA)屬于非編碼RNA,有些miRNA可以與目標基因mRNA的3′端非翻譯區(3′-UTR)結合,以此在轉錄水平調控基因表達,miRNA的異常表達與腫瘤的發生發展密切相關[3]。有研究[4-9]表明,許多miRNA作為腫瘤抑制因子在人類癌癥發生中發揮作用,例如miR-144-3p在肺癌、膠質瘤、甲狀腺癌、胃癌、膀胱癌、前列腺癌中表達水平降低,它可作為腫瘤抑制因子與下游靶基因結合抑制腫瘤的進展。E2F轉錄因子家族的主要功能是對細胞周期的調節,其功能的變化影響著腫瘤細胞的增殖、侵襲和遷移[10-11]。E2F8是新發現的E2F家族成員,其在KIRC中的生物學功能和臨床轉化意義尚未被研究,但是TargetScan軟件預測(https://www.targetscan.org)E2F8存在與miR-144-3p的結合位點,提示E2F8的表達可能受miR-144-3p的調節。本研究旨在探究miR-144-3p和E2F8在KIRC中的表達情況,并對其相互作用對KIRC細胞增殖和凋亡調控產生的影響展開研究,以期為KIRC的早期診斷和治療手段開發提供新的線索。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑

腎小管上皮細胞系HK-2和KIRC細胞系786-O,ACHN和OS-RC-2均購自武漢普諾賽生命科技有限公司;澳洲胎牛血清(FBS)、TransIntro?EL轉染試劑、Trizol總RNA抽提試劑購自北京全式金生物技術有限公司;RPMI1640培養基、DMEM培養基、胰蛋白酶購自北京索萊寶科技有限公司;熒光素酶試劑盒購自南昌聚焦生物科技有限公司;兔源多克隆E2F8抗體購自艾博抗(上海)貿易有限公司;CCK8試劑和細胞凋亡檢測試劑盒購自廣州銳博生物公司。

收集南昌大學第二附屬醫院泌尿外科2021年4月至2021年11月進行的10例腹腔鏡下腎癌根治術中獲取的腎癌及對應癌旁組織標本,保存于液氮中備用。

納入標準:患者術后病理組織學檢查確診腎透明細胞癌。排除標準:術前接受免疫治療或其他治療者。本研究已取得患者的知情同意,并通過醫院倫理委員會審核。

1.2 試驗方法

1.2.1 細胞培養

采用含10% FBS、1%青鏈霉素的RPMI1640培養HK-2、786-O、OS-RC-2細胞,采用含10% FBS、1%青鏈霉素的DMEM培養基培養ACHN細胞,并置于37 ℃、5%CO2的無菌恒溫培養箱中。選擇處于對數生長期的細胞進行后續實驗。

1.2.2 實時定量PCR

使用Trizol提取細胞和組織的總RNA,經逆轉錄合成cDNA模板后,使用熒光定量PCR試劑盒配置反應體系,在PCR儀中進行擴增,檢測miR-144-3p和E2F8 mRNA的表達水平。miR-144-3p上引物5′-GGCCGGCGTACAGTATAGATGA-3′;下引物5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′。內參基因U6上引物:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′;下引物:5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。E2F8上引物:5′-CCTGAGATCCGCAACAGA-GA

T-3′;下引物:5′-AGATGTCATTATTCACAGCAGGG-3′。內參基因GAPDH上引物:5′- AACGGATTTGGCCGTATTGG-3′;下引物:5′-CATTCTCGGCCTTGACTGTG -3′。反應條件:95 ℃ 34 s,60 ℃ 5 s,72 ℃ 1 min,共40個循環。采用2-ΔΔCt方法計算基因的相對表達水平。

1.2.3 蛋白免疫印跡

將細胞在RIPA裂解液中裂解,并用BCA法測定蛋白質濃度。將總蛋白樣品加入預制的SDS-PAGE凝膠,進行常規電泳后并轉移到聚偏二氟乙烯(PVDF)上。用5%脫脂牛奶對膜進行封閉處理1 h,用TBST清洗1次,4 ℃下孵育一抗過夜。用TBST清洗3次,每次10 min,然后在室溫下孵育二抗2 h。用TBST清洗3次,每次10 min,用化學發光試劑進行熒光顯色,用成像系統拍照并分析目標蛋白的相對表達量。

1.2.4 細胞轉染

取對數生長期的786-O細胞,用胰酶消化后接種到新6孔板中,當細胞生長至匯合度60%～70%時,遵循TransIntro?EL轉染試劑說明書將minic miR-144-3p載體及空白對照載體轉染至細胞中,分別標記為miR-144-3p組和miR-NC組。轉染后6 h,更換為含10% FBS的新鮮培養基。轉染后48 h,通過qRT-PCR檢測轉染效率。

采用上述轉染方法,將786-O細胞分為si-E2F8組(轉染si-RNA的表達載體,沉默E2F8表達)、si-NC組(轉染空載體,作為si-E2F8組的陰性對照)、anti-miR-144-3p組(轉染miR-144-3p表達的干擾載體)、anti-miR-NC組(轉染空載體,作為anti-miR-144-3p組的陰性對照)、 miR-144-3p+pcDNA-E2F8組(minic miR-144-3p載體與E2F8過表達載體共轉染)和miR-144-3p+pcDNA組(minic miR-144-3p載體與pcDNA空載共轉染,作為miR-144-3p+pcDNA-E2F8組的陰性對照)。

1.2.5 CCK8細胞增殖實驗

以104個·孔-1的密度將細胞接種于96孔板,每組設置4個復孔,并置于37 ℃、5% CO2的無菌恒溫培養箱中培養至細胞匯合度達60%;分別于生長0、24、48、72 h時,在不同的孔內加入10 μL的CCK8試劑,0.5 h后用酶標儀檢測450 nm波長處吸光值。

1.2.6 流式細胞術檢測細胞凋亡

以3×105個·孔-1的密度將細胞種植于6孔板,每組設置3個復孔,依照PI-APC試劑盒說明書處理細胞。用緩沖液重懸細胞,輕搖至均勻,孵育20 min。加入適量PI-APC,避光孵育30 min,上機檢測。

1.2.7 雙熒光素酶報告實驗

TargetScan生物信息學軟件預測miR-144-3p與E2F8存在結合位點,E2F8可能是miR-144-3p的一個靶基因。構建野生型E2F8(Wild-E2F8)和突變型E2F8(Mutant-E2F8)的質粒,按照1.2.4方法將空白對照載體和minic miR-144-3p載體分別與Wild-E2F8和Mutant-E2F8共轉染,并置于37 ℃、5% CO2無菌恒溫培養箱中培養48 h。收集各組細胞,按照熒光素酶基因報告試劑盒說明書進行檢測。

1.3 統計學方法

采用SPSS22.0和GraphPad Prism8軟件進行數據分析。組間比較采用t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 KIRC細胞系和組織中miR-144-3p和E2F8的表達情況

與腎小管上皮細胞系HK-2相比,KIRC細胞系786-O、ACHN和OS-RC-2中miR-144-3p表達水平均較低(P<0.001,圖1A),而E2F8蛋白和mRNA表達水平均較高(P<0.05、P<0.01和P<0.001,圖1A-B)。與癌旁組織相比,腎透明細胞癌組織中miR-144-3p表達水平較低(P<0.001),而E2F8 mRNA表達水平較高(P<0.01)。見圖1C。

A:miR-144-3p和E2F8在腎小管上皮細胞和腎癌細胞系中的表達;B:E2F8蛋白在腎小管上皮細胞和腎癌細胞系中的表達;C:miR-144-3p和E2F8在腎透明癌細胞癌和癌旁組織中的表達。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

2.2 過表達miR-144-3p抑制786-O細胞的增殖

miR-144-3p組786-O細胞中miR-144-3p水平顯著高于miR-NC組(P<0.05),說明過表達miR-144-3p的786-O細胞株構建成功,且其miR-144-3p組細胞中E2F8 mRNA的表達水平顯著下降(P<0.001)。與miR-NC組相比,miR-144-3p組細胞周期蛋白CCND1的表達量明顯降低,P27和P21的表達水平明顯升高(P<0.05);miR-144-3p組786-O細胞增殖能力較miR-NC組顯著下降(P<0.05)。見圖2。

A:過表達miR-144-3p對786-O細胞E2F8表達水平影響。*P<0.05,***P<0.001。

2.3 過表達miR-144-3p促進786-O細胞凋亡

流式細胞術分析結果表明,與miR-NC組相比,miR-144-3p組中凋亡細胞占比顯著增多(P<0.001)(圖3A)。并且,與miR-NC組相比,miR-144-3p組凋亡蛋白Bcl-2表達水平明顯降低,而Bax和Caspase-3表達水平明顯升高(P<0.05)。見圖3B。

A:流式細胞術檢測細胞凋亡;B:過表達miR-144-3p對786-O細胞凋亡蛋白表達的影響。*P<0.05,***P<0.001。

2.4 沉默E2F8表達抑制786-O細胞的增殖并促進凋亡

沉默E2F8表達的786-O細胞株(si-E2F8組)細胞增殖能力較si-NC組顯著降低(P<0.01)(圖4A)。與si-NC組相比,si-E2F8組細胞周期蛋白CCND1的表達量顯著降低,P21蛋白表達量則顯著升高(P<0.05)。與si-NC組相比,si-E2F8組凋亡蛋白Bcl-2表達量顯著降低,而Bax蛋白表達量顯著升高(P<0.05)。見圖4B。

2.5 miR-144-3p可靶向抑制E2F8的表達

TargetScan生物信息學軟件預測結果顯示,E2F8是miR-144-3p的潛在靶基因,miR-144-3p和E2F8 mRNA的3′UTR之間存在結合位點(圖5A)。與miR-NC+Wild-E2F8共轉染的細胞相比,mimic miR-144-3p+Wild-E2F8共轉染細胞中熒光素酶活性明顯下降(P<0.001),而miR-NC+Mutant-E2F8和miR-144-3p+Mutant-E2F8共轉染細胞內的熒光素酶活性無明顯差異(P>0.05)。見圖5B。與miR-NC相比,miR-144-3p組中E2F8蛋白表達水平明顯降低(P<0.05),而anti-miR-144-3p組中E2F8蛋白表達水平較anti-miR-NC組明顯升高(P<0.05)。見圖5C。

A:has-miR-144-3p與E2F8互補的核苷酸序列;B:雙熒光素酶報告實驗驗證miR-144-3p與E2F8 mRNA的相互作用;C:Western印跡檢測E2F8的表達。*P<0.05,***P<0.001。

2.6 過表達E2F8逆轉過表達miR-144-3p對786-O細胞增殖、凋亡的影響

與miR-144-3p+pcDNA組相比,轉染后miR-144-3p+pcDNA-E2F8組786-O細胞增殖活性顯著升高(P<0.05)。見圖6A。與miR-144-3p+pcDNA組相比,miR-144-3p+pcDNA-E2F8組CCND1、Bcl-2蛋白表達水平顯著升高,而P21、Bax蛋白表達水平顯著降低(均P<0.05)。見圖6B。

A:過表達E2F8逆轉過表達miR-144-3p對786-O細胞增殖能力的抑制作用;B:過表達E2F8逆轉過表達miR-144-3p對786-O細胞增殖、凋亡蛋白表達的作用。*P<0.05。

3 討論

由于早期癥狀的隱匿性和有效早期診斷方法的缺乏,許多新確診的腎透明細胞癌的患者已經處于疾病晚期,通常伴有局部或遠處轉移,導致預后不良[12]。因此需要尋找KIRC治療的新方案來改善患者預后。研究表明miRNAs與多種腫瘤的發生發展密切相關,可以通過調控下游分子的表達水平參與腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉移過程,并可作為癌癥的預后指標,所以鑒定腫瘤相關miRNA并預測其下游分子是相關研究中至關重要的內容[13-14]。miR-144-3p的編碼基因位于11號染色體上,包含一個非編碼轉錄單元,該轉錄單元也編碼miR-451[15]。有研究[4-9]證明miR-144-3p在腫瘤發展過程中扮演重要角色,與其靶向基因mRNA之間的相互作用影響著諸多腫瘤生物學過程。

在本研究通過TargetScan生物信息學軟件預測miR-144-3p和E2F8之間的互作關系,得出E2F8可能是miR-144的下游靶基因。已有研究[16-18]指出E2F8在人類黑色素瘤、卵巢癌、肝細胞癌和肺癌中過表達,并證實E2F8過表達與卵巢癌的組織病理學進展相關。還有報道[19]證明E2F8促進癌細胞增殖,幫助其建立抗藥性和侵襲性,可能是肝細胞癌和肺癌的潛在治療靶點。有研究[20]通過上調E2F8的表達調節細胞周期,增強了乳腺癌細胞增殖和致瘤能力。以上數據表明,E2F8可能作為miR-144-3p的下游靶基因,在癌癥的惡性進展中發揮重要作用。

本研究發現,與腎小管上皮細胞HK2相比,KIRC腫瘤細胞786-O、ACHN、OS-RC-2中miR-144-3p表達水平顯著降低,并與E2F8表達水平呈負相關,在收集到的KIRC組織標本中也得出了同樣結果。上調miR-144-3p的表達可以抑制786-O細胞增殖并促進其細胞凋亡,而沉默E2F8的表達也可以達到同樣性質的效果。過表達E2F8可以逆轉過表達miR-144-3p對KIRC細胞系786-O的增殖抑制和調控促進作用。熒光素酶報告實驗也證明miR-144-3p和E2F8 mRNA之間存在相互作用,miR-144-3p對KIRC中的抑制作用是通過與E2F8 mRNA 的3′-UTR結合,在轉錄水平調控E2F8表達來實現的。本研究結果表明E2F8是miR-144-3p下游靶基因,miR-144-3p可以通過靶向調控E2F8基因抑制KIRC腫瘤細胞786-O的增殖、促進其細胞凋亡,且miR-144-3p和E2F8表達的組合可能是KIRC患者預后的高敏感度標志物。

本研究在體外細胞系中驗證了miR-144-3p與靶基因E2F8的作用,但仍待動物模型實驗數據的支持。同時,需要進一步挖掘miR-144-3p在KIRC中可能發揮的其他功能以及與E2F8相關的信號通路,以明確其具體作用機制。