基于網絡藥理學研究扶正化瘀降濁通絡方治療慢性腎衰竭的作用機制*

何劍川,付饒,鄒小康,陳明

1.四川省中西醫結合醫院,四川 成都 610041; 2.成都中醫藥大學附屬醫院,四川 成都 610072

慢性腎衰竭(chronic renal failure,CRF)是慢性腎病持續發展的最終結局,主要表現為內環境失衡、代謝產物潴留及各系統癥狀,是各種原因導致腎功能進行性減退、代謝紊亂和臨床癥狀組成的綜合征[1]。CRF發病機制復雜,西醫治療手段有限,對患者的生命與生活質量產生嚴重影響。祖國醫學并無“慢性腎衰竭”這一病名記載,現代醫家根據證候特點及臨床表現,將其歸屬于“關格”“水腫” “腎勞”等范疇,認為“本虛標實,虛實夾雜”是其基本病機[2],“補脾益腎、通腑泄濁”是其治療大法。葉傳蕙教授基于此理論研發的具有扶正化瘀降濁功效的“腎康”廣泛應用于臨床,已成為治療CRF的重要藥物[3]。陳明教授在“腎康”的基礎上,結合防治肝臟纖維化中使用“大黃蟲丸”的經驗,化裁出“通補并用、標本兼施”的“扶正化瘀降濁通絡方”,該方以大黃、黃芪、熟地黃為君藥,丹參、紅花、酒水蛭、土鱉蟲為臣藥,黃芩為佐藥,甘草為使藥,諸藥合用,達到健脾益腎、理氣固本、通腑泄濁的目的。扶正化瘀降濁通絡方治療CRF療效確切,但尚未闡明其藥理學機制,值得深入研究。

在多學科理論的基礎上,網絡藥理學從不同角度分析藥物治療疾病的機制。該方法與中藥多成分、多靶點、多途徑的作用特點相契合[4],在中藥領域的研究中得到廣泛應用。本研究擬采取該方法探索扶正化瘀降濁通絡方治療CRF的藥效成分、藥物靶點、信號通路等信息,為今后基礎研究提供大致方向。

1 資料與方法

1.1 篩選主要活性成分經中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform,TCMSP)[5-6]收集大黃、黃芪、熟地黃、丹參、紅花、黃芩、甘草的化學成分,設置口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%、類藥性(drug-likeness,DL)≥0.18對化學成分進行篩選;通過TCMID數據庫收集水蛭化學成分,利用BATMAN-TCM數據庫[7]“藥物-靶點”相似性模型,設置分數截止點≥20,調整后P值≤0.05,篩選水蛭活性成分;通過檢索中國知網、維普網、萬方數據、PubMed、Web of Science等國內外文獻數據庫,查閱土鱉蟲活性成分相關文獻,收集土鱉蟲活性成分。結合PubChem、SwissADME數據庫對活性成分分子結構進行驗證,將結果保存為mol2格式文件。

1.2 預測潛在靶點登錄PharmMapper數據庫[8],上傳活性成分相關結果,下載藥物靶點名稱、蛋白庫編碼、擬合分數等信息。擬合分數用于評價活性成分與靶點的匹配度,分值越高,二者越匹配。為提高預測精度,靶點納入標準設為擬合分數≥3。將納入靶點的蛋白庫編碼整合到UniProt數據庫中,將其矯正為人類相關蛋白編碼。在GeneCards數據庫、在線人類孟德爾遺傳數據庫(online mendelian inheritance in man,OMIM)[9-10]輸入關鍵詞“Chronic Renal Failure”檢索CRF相關靶點,去重后構建CRF靶點庫。將扶正化瘀降濁通絡方作用靶點與CRF靶點數據上傳Venny2.1.0進行映射,交集靶點即為扶正化瘀降濁通絡方治療CRF的潛在靶點,并繪制靶點韋恩圖。

1.3 關鍵靶點相互作用網絡將潛在靶點導入STRING數據庫,進行蛋白互作(protein-protein interaction,PPI)分析,篩選自由度高于均值的靶點建立子網絡,選取子網絡中的關鍵靶點構建PPI網絡。將PPI網絡的節點1、節點2和綜合評分信息導入Gephi軟件[11],進行網絡分析和可視化分析。

1.4 “藥物-成分-靶點”網絡將關鍵靶點、藥物活性成分及其對應靶點的信息導入Cytoscape3.7.2軟件,建立“藥物-成分-靶點”網絡,選取各藥物核心靶點度值排名前3位的活性成分作為核心成分。

1.5 富集分析將關鍵靶點導入DAVID數據庫,進行基因本體(gene ontology,GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)信號通路富集分析。

1.6 “信號通路-靶點”網絡構建將CRF相關通路與相應靶點信息導入Cytoscape 3.7.2軟件構建并分析“信號通路-靶點”網絡。

1.7 “藥物-核心成分-核心靶點-信號通路”網絡整合研究所得有效信息,將藥物、核心化學成分、核心靶點及信號通路導入Cytoscape 3.7.2軟件構建并分析扶正化瘀降濁通絡方治療CRF的“藥物-核心成分-核心靶點-信號通路”網絡。

2 結果

2.1 藥物活性成分通過TCMSP數據庫收集到大黃92個、黃芪87個、熟地黃76個、丹參202個、紅花189個、黃芩143個、甘草280個化學成分,利用OB≥30%、DL≥0.18篩選得到大黃16個、黃芪20個、熟地黃2個、丹參65個、紅花22個、黃芩36個、甘草92個主要活性成分;通過 TCMID 數據庫檢索得到水蛭活性成分35個,利用BATMAN-TCM分析工具篩選得到主要活性成分15個,其中2個活性成分未找到相對應的作用靶點,通過分子結構驗證,最終篩選得到主要活性成分13個;通過對已報道的土鱉蟲活性成分進行系統整理,搜集得到活性成分76個,通過分子結構驗證,篩選得到主要活性成分50個。君藥大黃、黃芪、熟地黃的結果見表1。

表1 大黃、黃芪、熟地黃主要活性成分

2.2 潛在靶點合并重復項,剔除假陽性項后得到大黃1 360個、黃芪918個、熟地黃222個、丹參 1 404 個、紅花783個、黃芩916個、甘草1 589個、水蛭343個、土鱉蟲757個作用靶點,整合得到扶正化瘀降濁通絡方作用靶點2 263個。通過Genecards、OMIM構建CRF靶點庫,共涉及7 806個靶點。將二者進行映射,篩選出潛在靶點635個,見圖1。

圖1 潛在靶點VEEN圖

2.3 關鍵靶點PPI網絡潛在靶點PPI網絡包含635個節點,3 414條邊,節點自由度均值為10.9。子網絡包含242個節點,2 300條邊,節點自由度均值為19。子網絡中靶點自由度大于均值的關鍵靶點共130個。關鍵靶點PPI網絡包括130個節點,1 320 條邊,平均節點自由度為20.3,靶點自由度為均值3倍以上的核心靶點共20個,見表2、圖2。

表2 核心靶點匯總表

圖2 關鍵靶點PPI網絡

2.4 “藥物-成分-靶點”網絡將關鍵靶點、藥物活性成分及其對應靶點的信息導入Cytoscape 3.7.2軟件,建立“藥物-成分-靶點”網絡。各藥物與關鍵靶點存在相互作用的活性成分分別為大黃16個,黃芪20個,熟地黃2個,丹參57個,紅花20個,黃芩34個,甘草91個,水蛭7個,土鱉蟲41個,結果見圖3。各君藥度值排名前3位的活性成分見表3。

表3 君藥治療慢性腎衰竭的核心成分匯總表

圖3 “藥物-成分-靶點”網絡

2.5 GO富集分析GO富集分析共涉及662項生物功能,其中506項與關鍵靶點顯著相關(P<0.05),顯著相關項中包含分子功能98項,細胞成分50項,生物過程358項。按P值從低到高排序,取各類別中排名前10位的生物功能進行分析,見圖4。

圖4 GO富集分析

2.6 KEGG通路分析共涉及105條信號通路,與關鍵靶點顯著相關(P<0.05)的通路共96條。篩選出與CRF相關的20條關鍵信號通路進行分析,見圖5。

圖5 KEGG通路分析

2.7 “信號通路-靶點”網絡將相關通路與相應靶點信息導入Cytoscape3.7.2軟件,構建“信號通路-靶點”網絡,選取度值排名前10位的靶點進行分析,見表4、圖6。

表4 “信號通路-靶點”網絡排名前10位的靶點

圖6 “信號通路-靶點”網絡

2.8 “藥物-核心成分-核心靶點-信號通路”網絡將研究結果導入Cytoscape3.7.2軟件,建立“藥物-核心成分-核心靶點-信號通路”網絡,見圖7。

圖7 “藥物-核心成分-核心靶點-信號通路”網絡

3 討論

君藥是方中不可或缺且藥力居首,針對主病或主證起主要治療作用的藥物,扶正化瘀降濁通絡方以大黃、黃芪、熟地黃為君,大黃性寒、味苦,有涼血解毒、瀉下攻積、逐瘀通經等功效。大黃素甲醚二葡糖苷等蒽醌類成分可能是大黃的核心藥效成分。CRF發病機制復雜,正虛是發病的基礎,血瘀是主要病理改變,濁毒是疾病進展的首因[12]。針對血瘀這一病理改變,大黃可通過改變機體血流動力學特征、改善局部微循環、預防血栓形成等藥理作用發揮逐瘀通經的功效。現代藥理學研究表明,大黃可通過調節機體血管內滲透壓的變化,使細胞外液重新分布,從而改善腎臟微循環、改變機體血流動力學特征[13]。西醫代謝產物潴留的概念與中醫的濁毒極其相似,濁毒既是機體內積聚的病理產物,也是疾病發生發展的致病因素。大黃具有通利水谷、滌蕩胃腸的功效,可給邪出路,使濁毒從二便解,避免閉門留寇。大黃蒽醌類活性成分能有效抑制結腸水通道蛋白的表達,降低Na+-K+-ATP酶活性,從而增加腸道內水含量,避免大便過于干燥;還對腸壁黏膜和肌內神經叢有刺激作用,增加結腸的蠕動次數,發揮瀉下作用[14-15]。此外,大黃素亦能增加輸尿管平滑肌的活性,降低腎髓質基底膜側Na+-K+-ATP酶活性,起到通利小便的作用。因而可知,大黃蒽醌類活性成分可通過瀉下攻積、逐瘀通經等功效,對血瘀、濁毒等致病因素發揮治療作用。黃芪味甘、性溫,有補氣固表、利尿托毒等功效。本研究篩選得到20個黃芪主要成分,以黃酮類、多糖類、皂苷類成分為主。黃芪總黃酮在體內和體外均有免疫調節功能,能調控絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)、核轉錄因子(nuclear factor kappa B,NF-κB)在巨噬細胞中的表達,抑制IL-6、腫瘤壞死因子等炎癥因子的分泌,起到抗炎作用[16],還能抑制轉化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)表達、減輕炎癥反應、抑制大量NO生成,從而減少腎臟系膜細胞增殖、防止ECM過度生成、減輕腎臟結構損傷,延緩腎功能進展[17-18]。本研究篩選得到豆甾醇、谷甾醇2個熟地黃主要成分,二者均與多個關鍵靶點存在對應關系。此外,丹參、紅花、酒水蛭、土鱉蟲等藥物中也有多個活性成分與多個關鍵靶點之間存在對應關系,表明扶正化瘀降濁通絡方治療CRF具有“多成分”“多靶點”的特點。

扶正化瘀降濁通絡方治療CRF可能與凋亡過程的負調控、基因表達的正調控、細胞增殖的正調控等生物學過程有關,涉及胞外體、細胞外間隙、溶酶體等細胞成分,蛋白質結合、酶結合、受體結合等分子功能也參與其中。岳艷利等[19]使用不同濃度的黃芪總苷治療糖尿病小鼠發現,黃芪總苷能通過下調糖尿病小鼠腎臟TGF-β1的表達,進而抑制 COL-Ⅳ等ECM主要組成部分的積聚,有效阻止腎功能損害的進程。王杰[20]通過動物實驗研究發現,扶正化瘀降濁通絡方可抑制5/6腎切除大鼠腎組織TIMP-1的表達、促進MMP9的表達,使GBM堆積減少、COL-IV降解增加,發揮腎臟保護作用。提示扶正化瘀降濁通絡方可能通過減少細胞凋亡、抑制ECM合成等機制延緩CRF的進展。

整合PPI網絡與“相關通路-相應靶點”網絡中重要靶點的信息發現,靶點PIK3CA、AKT1、MAPK3、EGFR、VEGFA存在重疊,可能是該方治療CRF的首要靶點。KEGG通路分析結果表明:首要靶點主要涉及PI3K/Akt、HIF-1、VEGF、TGF-β、NF-κB、Toll-like、白細胞跨內膜遷移、B細胞受體、T細胞受體等通路。其中,PI3K/Akt、HIF-1、VEGF、TGF-β等信號通路與調節腎臟纖維化進程緊密相關。在梗阻型腎病大鼠的腎小管間質中Akt、磷酸化Akt表達水平顯著上升[21],大黃可下調PI3K/Akt的表達,減少大鼠腎間質中成纖維細胞的增生、炎癥細胞的侵蝕,減慢纖維化速度[22-23]。在CRF發展過程中,HIF-1、VEGF等通路扮演著重要角色,組織缺氧可激活HIF-1、VEGF等信號通路,從而平衡纖維化調節因子的表達,起到調控組織纖維化進程的作用[24]。陳艷瓊[25]通過扶正化瘀降濁通絡方治療5/6腎切除大鼠研究發現:與假手術組相比,模型組大鼠腎臟組織VEGF的表達顯著降低,且與時間成反比,治療組大鼠VEGF顯著增高。提示該方能上調CRF大鼠VEGF的表達,減少腎臟纖維化,延緩病程進展。TGF-β可促進腎小管上皮細胞轉分化、炎癥細胞募集與激活、ECM合成與沉積,導致腎臟纖維化[26]。何凱杰[27]通過5/6腎切除大鼠研究發現,扶正化瘀降濁通絡方可調節 TGF-β信號通路關鍵因子——降低Smurf 2表達水平、促進Smad7表達水平改善5/6腎切除大鼠腎纖維化程度。

近年來,大量研究揭示了CRF中腸道與腎臟之間的雙向作用關系,即“腸-腎軸”理論[28],為CRF的治療提供了新方向。腸道屏障受損是CRF“腸-腎軸”的核心環節。腸道免疫屏障中的Toll樣受體/核因子-κB(TLRs/NF-κB)信號通路既是腸道免疫屏障的組成部分,也是連接機械屏障及生物屏障的橋梁,該通路的激活可使腸道炎癥級聯放大[29]。Ren ZG等[30]研究證實CRF患者腸道菌群多樣性降低,硫酸吲哚酚、脂多糖、硫酸對甲酚等毒素增加,高水平的硫酸吲哚酚可激活腸上皮細胞TLRs/NF-κB通路,促進炎性細胞因子的生成并進入循環導致全身炎癥和CRF的進展,提示腸道黏膜免疫活化是誘導全身性微炎癥反應和CRF進展的重要病理機制,調控TLRs/NF-κB信號通路的表達是糾正腸道黏膜免疫偏移、促進腸道屏障功能修復、延緩CRF進展的關鍵。本研究發現,扶正化瘀降濁通絡方除了與PI3K/Akt、HIF-1、VEGF、TGF-β等腎臟纖維化經典通路密切相關外,還涉及NF-κB、Toll-like、B細胞受體、T細胞受體等炎癥和免疫相關的通路。這既是對扶正化瘀降濁通絡方治療CRF相關研究結果的一個佐證,也為該方更明確的機制研究提供了參考依據。結合“腸-腎軸”理論及相關領域的研究進展,扶正化瘀降濁通絡方能否通過重塑腸道菌群穩態,平衡腸腎免疫微環境而調控“腸-腎軸”以延緩CRF進展呢?結合本研究結果推測,扶正化瘀降濁通絡方可能通過平衡腸道菌群失調,調節TLRs/NF-κB信號通路的表達,從而減輕腸道及全身炎癥反應,調控機體免疫功能,發揮腎臟保護作用,但該假說有待進一步多學科研究的驗證。