響應面法優化牛蒡根多酚的閃式提取工藝

張朋，丁朋，丁利，耿影，付婷偉 ，寧曉雅

1.徐州天益食品科技研究院有限公司（徐州 210009）；2.徐州工程學院食品（生物）工程學院（徐州 221111）；3.江蘇省食品資源開發與質量安全重點建設實驗室，徐州工程學院（徐州 221111）

多酚類物質是植物的重要代謝產物，廣泛存在于果蔬、谷物、豆類等植物組織中[1]。就植物自身而言，多酚類物質對其生長和繁殖會起到不可替代的作用[2]。現代研究表明，多酚類物質具有顯著的自由基清除、防衰抗老、防輻射、抗癌、降糖、抑制脂質過氧化、防治心腦血管疾病等多重生理功效[3-6]。此外，多酚類物質作為天然的功能因子還可在食品加工過程中輔助形成特定食品的苦澀味、顏色、香氣，是食品感官及營養質量的重要決定因素[7]。因此，植物源多酚類物質具有巨大的開發潛力和應用潛力。

牛蒡根是我國傳統的具有較高藥用價值和保健價值的藥食用蔬菜[8]。牛蒡根富含膳食纖維、蛋白質、氨基酸、維生素、菊糖、牛蒡苷、多酚等成分[9-10]，具有提高機體免疫，防治糖尿病、性機能減退、便秘等功效，在治療風濕、中風等方面效果明顯[11-12]。牛蒡多酚是牛蒡的重要活性物質，現代研究顯示牛蒡多酚作為牛蒡生物保健功能物質的地位[13]。因此開展牛蒡多酚類物質的檢測、提取、分離純化、功能驗證等方面的系列研究對于牛蒡產業的發展具有現實意義。采用響應面法優化牛蒡根多酚閃式提取工藝條件，并探討其體外抗氧化活性，為拓展牛蒡精深加工路徑、實現牛蒡功能因子產業化提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮帶皮牛蒡干燥切片[天益食品（徐州）有限公司]；苯酚（國藥集團化學試劑有限公司）；30%過氧化氫（H2O2，Aladdin公司）；蘆丁、沒食子酸、福林酚（上海葉源生物科技有限公司）；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

閃式提取器ZBEH-50T（河南智晶生物科技發展有限公司）；L-550高速離心機（長沙湘儀離心機儀器有限公司）；TU-1810紫外分光光度計（北京普析通用有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 牛蒡根預處理

使用粉碎機將牛蒡根干切片粉碎后過0.250 mm（60目）篩，牛蒡粉裝于自封袋中于干燥器中保存，備用。

1.3.2 多酚含量的測定

1.3.2.1 標準曲線的繪制

準確稱取0.010 0 g沒食子酸標準品于燒杯中，用蒸餾水溶解后轉入100 mL容量瓶中定容，得質量濃度為0.10 mg/mL的沒食子酸標準品溶液。分別量取0，0.25，0.50，0.75，1.00，1.25和1.50 mL 0.10 mg/mL沒食子酸標準品溶液于25 mL棕色容量瓶，加入10 mL蒸餾水，再加入1 mL福林酚，搖勻后加入10 mL 7%的Na2CO3溶液，搖勻后定容至25 mL，即得質量濃度分別為0，0.01，0.02，0.03，0.04，0.05和0.06 mg/mL的沒食子酸溶液，于常溫避光放置30 min，在波長765 nm處測定吸光度，以沒食子酸溶液濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線。

1.3.2.2 多酚得率的計算（式1）

式中：C為多酚提取液質量濃度，mg/mL；N為稀釋倍數；V為提取液體積，mL；M為牛蒡質量，mg。

1.3.3 牛蒡根中多酚的提取

1.3.3.1 提取溫度對牛蒡多酚得率的影響

取適量牛蒡粉，按料液比1︰40 g/mL加入體積分數70%的乙醇，在提取電壓100 V條件下，分別在50，60，70，80和90 ℃條件下用閃式提取器提取60 s，得到的提取液在4 000 r/min條件下離心15 min，使用1.3.2小節的方法計算多酚得率。

1.3.3.2 料液比對牛蒡多酚得率的影響

取適量牛蒡粉，分別按料液比1︰10，1︰20，1︰30，1︰40和1︰50 g/mL加入體積分數70%的乙醇，在提取電壓100 V、提取溫度70 ℃條件下，用閃式提取器提取60 s，得到的提取液在4 000 r/min條件下離心15 min，使用1.3.2小節的方法計算多酚得率。

1.3.3.3 提取時間對牛蒡多酚得率的影響

取適量牛蒡粉，按料液比1︰40 g/mL加入體積分數70%的乙醇，在提取電壓100 V、提取溫度70 ℃條件下，用閃式提取器分別提取50，60，70，80和90 s，得到的提取液在4 000 r/min 條件下離心15 min，使用1.3.2小節的方法計算多酚得率。

1.3.3.4 Box-Behnken試驗設計及響應面分析

在單因素試驗結果基礎上，采用Box-Behnken設計方案，以提取溫度（A）、料液比（B）、提取時間（C）為考察因素，以牛蒡多酚得率為響應值，使用Design-Expert 8.06軟件優化多酚提取工藝參數。因素水平見表1。

表1 試驗因素及水平

2 結果與分析

2.1 多酚標準曲線的繪制

采用1.3.2.1的方法繪制多酚標準曲線，如圖1所示。

圖1 沒食子酸標準曲線

標準曲線的回歸方程為y=9.607 1x+0.105 4，相關系數R2=0.999，在沒食子酸質量濃度0~0.07 mg/mL范圍內，線性關系良好。

2.2 單因素對牛蒡多酚提取的影響

2.2.1 提取溫度對牛蒡多酚提取的影響

在不同的提取溫度下，牛蒡多酚的得率不同。考察不同提取溫度對牛蒡多酚提取的影響，結果如圖2所示。

圖2 提取溫度對牛蒡多酚得率的影響

結果表明，牛蒡多酚得率隨著提取溫度的升高而提高。提取溫度80 ℃時，提取率達0.72%±0.04%，提取溫度升高至90 ℃時，多酚提取率為0.75%±0.05%。2種溫度條件下，多酚得率間未表現顯著差異，因此確定牛蒡多酚的提取溫度選擇80 ℃。

2.2.2 料液比對牛蒡多酚提取的影響

采用1.3.3.2的方法探討料液比對牛蒡多酚提取的影響。具體的結果如圖3所示。

圖3 料液比對牛蒡多酚得率的影響

結果表明，不同料液比會對多酚得率產生較明顯影響。料液比1︰30 g/mL時，多酚得率達到0.57%，隨著料液比繼續增大，多酚得率反而驟然下降，說明料液比1︰30 g/mL可有效溶出牛蒡根中的多酚物質，因此選擇1︰30 g/mL作為牛蒡多酚提取的最優料液比。

2.2.3 提取時間對牛蒡多酚提取的影響

提取時間對牛蒡多酚提取的影響結果如圖4所示。

圖4 提取時間對牛蒡多酚得率的影響

結果顯示，提取時間70 s內多酚得率隨著提取時間的延長而顯著升高，提取時間70~90 s內，多酚得率趨于平緩，數值上未有顯著變化。因此確定70 s為牛蒡多酚閃式提取的最佳提取時間。

2.3 響應面法優化牛蒡多酚提取工藝

2.3.1 回歸模型的建立及顯著性檢驗

以牛蒡多酚得率為響應值，采用Box-Behnken設計方案優化牛蒡根中多酚的提取工藝。試驗設計及結果見表2，方差分析結果見表3。利用Design Expert 8.06軟件對表2中數據進行分析，得到響應值對自變量的回歸方程：Y=0.75+0.082A-0.028B-0.047C+0.034AB-0.036AC+0.031BC-0.054A2-0.049B2-0.072C2。

表2 Box-Behnken響應面設計及其結果

表3 方差分析表

由方差分析結果可知，該回歸模型極顯著（P＜0.01），失擬項（P=0.152 3）不顯著，表明試驗值與預測值顯著相關（R2=0.986 3，Radj2=0.960 1），模型與試驗擬合良好，該模型可以反映牛蒡多酚得率的預測及分析。由表3還可以發現自變量對響應值即多酚得率的影響程度，其影響大小排序依次為提取溫度（A）＞提取時間（C）＞料液比（B），其中因素A對多酚得率影響極顯著（P＜0.01），因素B、C和AC的交互作用對多酚得率的影響顯著（P＜0.05）。

2.3.2 牛蒡多酚提取響應面分析與優化

兩兩因素間的交互作用對牛蒡多酚得率的影響如圖5所示。圖中曲面越陡，變量對多酚得率影響就會越大。影響因素提取溫度和提取時間的交互作用顯著影響牛蒡多酚得率（P＜0.05），而提取溫度與料液比、提取時間與料液比間的交互作用對得率的影響不顯著（P＞0.05）。使用軟件分析，牛蒡多酚的最優提取參數為提取溫度83.70 ℃、料液比1∶30.15 g/mL、提取時間67.78 min，此條件下牛蒡多酚得率為0.777 8%。經全面綜合考慮，修正提取參數：提取溫度84 ℃、料液比1∶30 g/mL、提取時間68 min。經驗證，此條件下多酚得率為0.779 3%。預測值與實際值間的相對偏差為-0.001 5，說明可以使用該模型預測牛蒡多酚的提取情況。

圖5 兩兩因素交互作用對牛蒡多酚提取影響的響應面圖

3 結論

在單因素試驗基礎上，以多酚得率為指標，采用響應面分析法優化牛蒡多酚閃式提取工藝。使用該方法建立的牛蒡多酚提取得率的預測模型為Y=0.75+0.082A-0.028B-0.047C+0.034AB-0.036AC+0.031BC-0.054A2-0.049B2-0.072C2。最優提取條件為提取溫度84 ℃、料液比1∶30 g/mL、提取時間68 min。在該條件下牛蒡多酚得率達0.779 3%。試驗對牛蒡多酚閃式提取工藝進行優化，獲得的預測模型可有效預測牛蒡多酚的提取情況。閃式提取工藝的使用不僅可以避免傳統提取方法可能帶來的有效成分被破壞的弊端，還可有效提高活性成分的提取效率、縮短提取時間、減少提取溶劑使用量等，是活性成分提取的有效方法。牛蒡多酚閃式提取工藝的優化有助于開拓牛蒡產業發展路徑，挖掘牛蒡資源的開發應用潛力，同時為天然功能因子的產業化提供思路與參考。