青花椒精油柔性脂質體的制備及質量評價

劉艷苓，董紅霞，龍澤麗，韓陽，韓靜

1.沈陽藥科大學制藥工程學院（沈陽 110016）；2.沈陽藥科大學功能食品與葡萄酒學院（沈陽 110016）；3.沈陽藥科大學中藥學院（沈陽 110016）

青花椒（Zanthoxylum schinifoliumSieb.et Zucc，Z.schinifolium）是蕓香科花椒屬植物中的一種[1]，是我國傳統的中藥[2]和調味劑[3]，是藥食同源的植物[4]。原產于中國南部、孟加拉國、不丹、印度北部等地[5]。《中國藥典》中記載花椒是青椒的干燥成熟果皮，具有溫中止痛、殺蟲止癢的功效[6]。現代藥理研究表明，青花椒及其提取物具有抗菌、抗氧化、抗炎鎮痛、抗腫瘤和降血糖等藥理活性[7]。事實上，花椒作為一種藥用植物在亞洲已經被使用數千年，在初級衛生保健中發揮著重要作用[8]。

青花椒精油作為青花椒的主要活性成分，是一種復雜的有機化合物混合物，具有清爽和麻木的味道，是花椒香氣和特殊風味的主要來源，也是判斷花椒品質的重要依據，具有藥輔合一的作用[9]。近年來，從藥用植物或草藥中提取的天然產物已經成為一種醫學界重要補充治療方法[10]?；ń肪妥鳛橐环N公認的安全物質[11]，含有許多易降解和高揮發性的生物活性物質[12]。Rashed等[13]通過分離得出，青花椒精油中芳樟醇為主要成分，占57.54%。由此表明，芳樟醇是青花椒精油當中含量最高的成分。但青花椒精油本身存在穩定性差、生物利用度低等問題，因此充分利用青花椒精油促進藥物經皮滲透的優點，將其開發成穩定安全的經皮給藥制劑具有重要意義。

1 儀器與材料

1.1 儀器與設備

日立Primaide高效液相色譜儀（日本Hitachi公司）；Zetasizer Nano ZS激光粒度測量儀（英國Malvern公司）；ATY124精密電子天平（日本Shimadzu公司）；SHA-BA水浴恒溫振蕩器（江蘇科析儀器有限公司）；Scientz-IID超聲波細胞破碎機（寧波新芝生物科技有限公司）；SHZ-D（Ⅲ）循環水式真空泵（鞏義市予華儀器有限責任公司）。

1.2 材料與試劑

青花椒（云南泰瑞農林發展有限公司）；芳樟醇對照品、氫化大豆卵磷脂、泊洛沙姆188（上海麥克林生化科技有限公司）；膽固醇（天津光復精細化工研究所）；1, 2-丙二醇（天津恒興化學試劑有限公司）；氯仿（天津利安隆博華醫藥化學有限公司）；甲醇（天津康科德科技有限公司）；純凈水（杭州娃哈哈集團有限公司）。

2 方法與結果

2.1 青花椒精油的提取

依據2020版《中國藥典》第四部中精油測定法（甲法）來提取青花椒精油：稱取50 g預處理過的青花椒粗粉加入到1 000 mL燒瓶中，加入數顆沸石，取10倍量超純水浸泡1 h后，加熱微沸4 h，靜置10 min，收集青花椒精油。

2.2 青花椒精油納米柔性脂質體的制備

采用薄膜-超聲法制備青花椒精油柔性納米脂質體，用分析天平分別精密稱取一定量的氫化大豆卵磷脂、膽固醇置于10 mL茄形瓶中，加入適量氯仿和甲醇（2∶1，V/V），加熱至完全溶解，室溫條件下減壓蒸餾除去有機溶劑，至瓶壁上出現均勻的干燥脂質薄膜，待有機溶劑完全除去，取下茄形瓶。另將1%（V/V）丙二醇與青花椒精油超聲互溶，加入水和表面活性劑，制備成青花椒精油混懸液。在一定溫度下，向類脂膜中逐滴加入青花椒精油混懸液，攪拌水化，取出后用超聲波細胞破碎儀冰水浴超聲，即得到青花椒精油柔性脂質體。

2.3 精油中芳樟醇含量方法學的建立

2.3.1 色譜條件

色譜柱：日立Primaide高效液相色譜儀 ODS C18液相色譜柱（4.6×250 mm，5 μm）；流動相：乙腈-水（50︰50，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：205 nm，柱溫30 ℃；進樣量：10 μL[14]。

2.3.2 線性關系

精確稱取芳樟醇對照品，用乙腈稀釋成11.32，22.64，45.28，67.92，90.56，113.20和566.50 μg/mL標準稀釋溶液。以芳樟醇濃度（X）對峰面積（Y）作線性回歸，得回歸方程Y=15 080X+268 299（R2=0.999 7）。結果表明在11.32~566.50 μg/mL內的藥物質量濃度線性關系良好。

2.3.3 方法學考察

精密度結果顯示，同一份樣品平行檢測6次，峰面積的SRSD值為1.44%；穩定性結果顯示，同一份樣品在0，2，4，6，8，10，12和24 h內檢測的峰面積值SRSD為1.29%；加樣回收率結果顯示，高，中，低濃度的青花椒精油加到樣品中的加樣回收率分別為97.66%，95.47%和96.22%；上述結果表明儀器參數相對良好，均符合規定，表明該方法可準確檢測青花椒精油含量。

2.4 包封率的測定方法

采用超濾-離心法測定青花椒精油柔性脂質體的包封率。精密量取一定量的花椒精油柔性脂質體，加入適量乙腈破乳并稀釋定容至5 mL，渦旋2 min，過0.22 μm微孔濾膜后，按2.3.1小節的色譜條件測定總芳樟醇的濃度。精密量取等量的柔性脂質體于超濾管上層套管中，在925g條件下離心15 min。收集下管濾液，用乙腈稀釋定容至5 mL，過0.22 μm微孔濾膜后，按相同色譜條件測定游離芳樟醇的濃度。包封率EE（%）按式（1）計算。

式中：Ctota為脂質體中總芳樟醇的質量，mg；Cfree為脂質體中游離芳樟醇的質量，mg。

2.5 單因素考察

2.5.1 處方單因素

表面活性劑種類篩選結果（圖1）顯示：泊洛沙姆188和吐溫80制備的脂質體粒徑與包封率相當，考慮到吐溫80有一定的毒性，因此選擇泊洛沙姆188（F 68）作為表面活性劑；不同氫化大豆卵磷脂與膽固醇質量比和氫化大豆卵磷脂與F 68對脂質體粒徑和包封率的響應趨勢相似，即隨著質量比增加，脂質體粒徑呈下降趨勢，包封率呈上升趨勢，當氫化大豆卵磷脂與膽固醇質量比達到10∶1（或氫化大豆卵磷脂與泊洛沙姆188質量比達到8∶1）時，脂質體粒徑呈上升趨勢，包封率呈下降趨勢；不同藥物加入量結果顯示，加藥量的多少對包封率的影響小于對粒徑的影響，藥物加入量4 mg時粒徑最小，包封的藥物最多，更易于藥物的吸收。

圖1 處方單因素考察結果

2.5.2 工藝單因素

不同超聲時間結果（圖2）顯示：當超聲時間增加從5 min至10 min時，脂質體粒徑下降而后隨著時間延長，仍明顯地降低脂質體粒徑，說明適當延長超聲時間能夠有效地控制脂質體粒徑；不同超聲功率結果顯示，超聲功率對粒徑的影響較大，可能是由于超聲探頭發出的能量受到粒子影響，在容器中分布不均勻，需要達到一定的超聲功率，才能顯著地降低脂質體的粒徑，提高粒子的均勻度；不同水合時間和溫度對脂質體粒徑和包封率的響應趨勢相似，觀察脂質體包封率變化，結果發現隨著水合溫度上升，脂質體包封率增大，但水合溫度過高，使磷脂膜結構變得松散，降低脂質體穩定性，導致藥物滲漏。

圖2 工藝單因素考察結果

圖3 自變量A，B，C與因變量等高線圖

2.6 Box-Behnken試驗優化設計

2.6.1 Box-Behnken設計-響應面法優化試驗

根據單因素試驗，選擇對青花椒精油柔性納米脂質體影響較大的3個因素，即氫化大豆卵磷脂與膽固醇的質量比（A）、氫化大豆卵磷脂與泊洛沙姆188的質量比（B）和超聲功率（C），每個因素取3個水平，設計三因素三水平Box-Behnken試驗（見表1），以粒徑（Y1）和包封率（Y2）為評價指標，優化精油脂質體工藝條件。采用Design-Expert 8.0.6軟件對表2數據進行處理，獲得Y1與Y2值對自變量A，B，C的二次多項式回歸方程：

表1 響應面試驗設計因素與水平

表2 Box-Behnken試驗結果

Y1=115.82+0.44A-0.062B-5.00C-0.48AB-0.25AC-1.20BC+5.88A2+5.93B2+9.70C2

Y2=91.27+0.62A+0.76B+2.3C+0.41AB+0.30AC-0.51BC-2.42A2-3.02B2-5.82C2

根據回歸模型方差分析結果表3可知，各模型的P值均＜0.000 1，說明各回歸模型極為顯著。各模型的失擬項P值均＞0.05，表示異常因素對方程擬合的影響很小，可預測各因素對響應值的影響。相關系數R2分別為0.993 6和0.976 2，均＞0.9，說明各模型擬合程度較良好，模型的預測值與試驗值相近，具有良好的相關性，可用于對柔性脂質體的預測和分析。進一步分析方程中的各項可知：C，BC，A2，B2，C2是Y1模型的顯著性影響因素；C，A2，B2，C2是Y2模型的顯著性影響因素。

表3 青花椒精油柔性脂質體方差分析結果

2.6.2 驗證試驗

根據Box-Behnken試驗預測，當包封率最大，粒徑最小時，最優工藝條件為氫化大豆卵磷脂與膽固醇的質量比10.2∶1、氫化大豆卵磷脂與泊洛沙姆188的質量比8.16∶1和超聲功率為351.5 W，預測的包封率和粒徑分別為91.57%和115.21 nm。根據實際工藝調整最優工藝條件：氫化大豆卵磷脂與膽固醇的質量比10∶1、氫化大豆卵磷脂與泊洛沙姆188的質量比8∶1和超聲功率352 W，表4中所得柔性脂質體包封率和粒徑與預測值的相對誤差＜5%，SRSD＜2%，說明該試驗設計具有良好的參考性和準確性。

表4 最優處方的驗證試驗

2.7 青花椒精油柔性納米脂質體的質量評價

2.7.1 柔性脂質體外觀

此研究制得的青花椒精油柔性脂質體外觀如圖4所示。通過肉眼觀察，新鮮的柔性脂質體樣品均為澄清，泛藍光的溶液，用激光筆照射可以明顯看到一條光亮的通路，證明所制備制劑為均勻的納米制劑。

圖4 青花椒精油柔性脂質體的外觀

2.7.2 粒徑和Zeta電位

采用Zetasizer Nano ZS納米粒度電位儀測定脂質體樣品的粒徑、多分散系數（PDI）及Zeta電位。結果表明，青花椒納米柔性脂質體的粒徑為115.81±2.11 nm（n=3），多分散系數PDI為0.236±0.110（n=3），Zeta電位為-50.21±2.35 mV（n=3）。此研究制得的青花椒油納米柔性脂質體粒徑分布均勻且穩定性良好，粒徑分布及Zeta電位分布見圖5。

圖5 青花椒精油柔性納米脂質體粒徑（A）和電位（B）

2.8 體外經皮滲透

2.8.1 在離體皮膚制備

在小鼠腹部涂抹脫毛膏進行脫毛處理后，用生理鹽水洗凈，正常飲水飲食，飼養24 h后處死，用鑷子剝離無毛的腹部皮膚，去除多余皮下脂肪，用生理鹽水洗凈，濾紙吸干，冷藏備用。

2.8.2 體外透皮吸收試驗

采用改良的Franz擴散池測定青花椒精油柔性脂質體的滲透吸收規律。將備用的鼠皮從冰箱冷藏室中取出，恢復至室溫，用濾紙盡可能將水分吸干。把鼠皮小心放于擴散池的供給池和接收池中間，角質層在供給池一側，用夾子固定供給池和接收池，接收池內裝滿含20%（V/V）乙醇的生理鹽水。取1.0 mL優化的柔性脂質體及相同質量濃度的原料藥置于鼠皮上。在37±0.5 ℃恒溫水浴中，調整轉速為300 r/min進行透皮試驗。于0，1，2，4，6，8，10，12，24和48 h取樣0.2 mL，隨即補等量37 ℃的20%（V/V）乙醇的生理鹽水。取得的樣品均用0.22 μm濾膜過濾，HPLC進樣。從釋放曲線（圖6）看出，原料藥在8 h時釋放完全，柔性脂質體與原料藥相比有明顯促進藥物吸收和緩釋釋放作用，48 h后納米粒積累滲透量149.24 μg/cm2，是原料的1.77倍。

圖6 青花椒精油柔性脂質體和原料藥的體外滲透曲線

3 結論

添加表面活性劑制備的柔性納米脂質體擁有比游離藥物更好的釋放特性，測得的粒徑為115.81±2.11 nm（n=3），多分散系數為0.236±0.110（n=3），Zeta電位為-50.21±2.35 mV（n=3）。透皮試驗結果顯示，青花椒精油的累積釋放量提高約1.77倍。同時有研究表明，納米脂質體的Zeta電位絕對值越大，制劑越穩定[16]，進一步說明表面活性劑的添加還能提高青花椒精油柔性納米脂質體的儲藏穩定性。以納米封裝技術為基礎的頭透皮給藥系統，不僅能夠保護中藥活性成分藥物免受破壞，提高關鍵藥物的穩定性，而且有利于對藥物的攝取，提高中藥活性成分藥物吸收。