竹蟲蛋白肽的制備及其活性研究

朱靜靜，王艷萍，唐川惠，早春娟

德宏職業(yè)學(xué)院（德宏 678400）

竹蟲，又名竹蛆、竹蠹螟，屬鱗翅目螟蛾科昆蟲，國內(nèi)主要分布于云南南部的西雙版納州、德宏州、紅河州等地區(qū)，寄生在竹筒內(nèi)，是云南當(dāng)?shù)厣贁?shù)民族的傳統(tǒng)美食[1-2]。研究表明，竹蟲在云南德宏為1年1代，卵最早7月上旬出現(xiàn)，至9月上旬結(jié)束；幼蟲最早于7月上旬出現(xiàn)，至次年6月中旬結(jié)束，次年5月中開始化蛹，整個幼蟲期長達(dá)300 d左右；蛹最早于5月中旬出現(xiàn)，于9月下旬結(jié)束，蛹期50 d左右；成蟲7月初開始出現(xiàn)，9月上旬結(jié)束[3-4]。

相關(guān)研究表明，昆蟲是一類高質(zhì)量的動物蛋白質(zhì)資源口[5-8]。昆蟲體內(nèi)的蛋白質(zhì)含量豐富，在已有營養(yǎng)成分分析中表明，近百種食用昆蟲中，無論供食用的蟲態(tài)是卵、幼蟲、蛹還是成蟲，其蛋白質(zhì)含量均十分豐富，粗蛋白含量一般在20%~70%[9-12]。王琦等[13]對竹蟲的氨基酸、糖、脂肪等營養(yǎng)成分和無機(jī)元素與維生素等進(jìn)行分析，結(jié)果表明竹蟲含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪及B族維生素和維生素PP等。陳曉鳴等[9]對竹蟲的營養(yǎng)成分進(jìn)行分析，結(jié)果表明竹蟲蛋白質(zhì)含量可達(dá)30%~40%，氨基酸含量為29.9%，粗脂肪含量為60.42%，不飽和脂肪酸含量為55.9%，營養(yǎng)豐富。張美玲等[14]對竹蟲菌落總數(shù)和大腸桿菌群進(jìn)行測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其腸道內(nèi)含有沙門菌和志賀菌等致病菌，因此竹蟲須高溫油炸后才能食用。

試驗旨在用蛋白酶水解制備竹蟲蛋白肽，得出最佳制備工藝，并研究其抗氧化活性及對小鼠肺成纖維細(xì)胞增殖活性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 試驗材料與試劑

竹蟲（云南西雙版納）；胰蛋白酶（250 U/mg）、堿性蛋白酶（200 000 U/g）、胃蛋白酶250 U/mg）、木瓜蛋白酶（800 000 U/g），北京索萊寶科技有限公司；1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、氫氧化鈉、無水硫酸銅、酒石酸鉀鈉，昆明傲雪科技有限公司。

1.1.2 試驗儀器與設(shè)備

SHZ-82恒溫振蕩器（金壇市大地自動化儀器廠）；URA14M0018分光光度計（上海翱藝儀器有限公司）；TGL20M高速冷凍離心機(jī)（湖南湘立科學(xué)儀器有限公司）；HWS24型水浴鍋（金壇市城西麗華實驗儀器廠）。

1.2 方法

1.2.1 竹蟲粗蛋白制備

1.2.1.1 試驗材料預(yù)處理

冷凍竹蟲加液氮研磨，過0.850 mm（20目）篩，自然風(fēng)干除去水分，竹蟲粉與無水乙醚按照1︰30（g/mL）的比例進(jìn)行脫脂，自然風(fēng)干，得到脫脂竹蟲粉，密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.2 竹蟲蛋白的制備

根據(jù)陳翔宇等[15]的研究加以改進(jìn)。稱取1 g脫脂竹蟲粉，加入30 mL 1.4 mol/L的氫氧化鈉溶液，于50 ℃恒溫振蕩20 min，按4 000 r/min離心20 min，取上清液，加1 mol/L的稀鹽酸調(diào)節(jié)至等電點pH 4.4，離心收集沉淀，冷凍干燥即得竹蟲粗蛋白。

1.2.2 竹蟲蛋白肽的制備

1.2.2.1 蛋白肽水解酶的篩選

分別取胰蛋白酶（250 U/mg）、堿性蛋白酶（200 000 U/g）、胃蛋白酶（250 U/mg）、木瓜蛋白酶（800 000 U/g），按照各種酶的包裝標(biāo)簽設(shè)置不同條件（胰蛋白酶pH 7.6~8.0、37~40 ℃，堿性蛋白酶pH 9.0~12.0、40~50 ℃，胃蛋白酶pH 2.0~4.0、低于60℃，木瓜蛋白酶pH 6.0~7.0、40~60 ℃），對竹蟲蛋白進(jìn)行水解，根據(jù)肽得率選擇最佳提取蛋白酶。

1.2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

根據(jù)相關(guān)研究方案加以改進(jìn)[16-18]。分別取0.2，0.4，0.6，0.8和1.0 mL 2 mg/mL的谷胱甘肽（GSH）于10 mL容量瓶中，補(bǔ)加蒸餾水至10 mL，搖勻，各取2 mL于10支試管內(nèi)，分別依次加入1 mL 0.02 g/mL酒石酸鉀鈉、1 mL 5%氫氧化鈉、0.3 mL 1%硫酸銅，搖勻，靜置10 min，于310 nm波長處測定吸光度。計算得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=0.502 3x-0.135 1，R2=0.991 7。（y為吸光度；x為谷胱甘肽含量，mg/mL）

樣品的測定，將谷胱甘肽換成樣品即可。

1.2.2.3 蛋白肽的制備工藝研究

稱取1 g竹蟲蛋白，加30 mL蒸餾水溶解，調(diào)節(jié)pH 7.68~8.00，加胰蛋白酶水解，沸水浴滅酶10 min，按5 000 r/min離心20 min，取10 mL上清液，加入10 mL 10% TCA溶液，混勻，靜置10 min，離心（5 000 r/min，20 min），上清液于60 ℃水浴5 min，取2 mL，依次加入1 mL 0.02 g/mL酒石酸鉀鈉、1 mL 5%氫氧化鈉、0.3 mL 1%硫酸銅，搖勻，靜置10 min，蒸餾水代替樣品作為空白調(diào)零，測定吸光度，計算肽得率。

1.2.3 單因素試驗

研究不同加酶量（60，70，80，90和100 mg/g）、不同水解溫度（30，35，40，45和50 ℃）、不同水解時間（30，60，90，120和150 min）和不同pH（6，7，8，9和10）對竹蟲蛋白肽得率的影響情況。

1.2.4 響應(yīng)面試驗設(shè)計竹蟲蛋白肽提取工藝

參照單因素結(jié)果，利用Box-Behnken試驗設(shè)計，進(jìn)行四因素三水平的試驗設(shè)計，優(yōu)化竹蟲蛋白肽提取的工藝參數(shù)。響應(yīng)面分析因素及水平見表1。

表1 響應(yīng)面分析因素及水平表

1.2.5 竹蟲蛋白肽的分離

用分子量10和5 kDa的超濾膜分級過濾水解液，使不同分子量的多肽從溶液中分離出來，得到不同分子量段（MW＞10 kDa、5 kDa＜MW＜10 kDa、MW＜5 kDa）的竹蟲蛋白肽，冷凍干燥，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6 竹蟲蛋白肽活性研究

1.2.6.1 DPPH自由基清除能力測定

參考吳暉等[19]的方法，將2 mL無水乙醇與2 mL 2.0 μmol/mL的DPPH-乙醇溶液，加入同一試管中，搖勻，暗處靜置30 min，用無水乙醇做參比，于波長517 nm處測定吸光度A0；測定樣品清除能力時，將2 mL樣品與2 mL DPPH-乙醇溶液，于試管中混勻，暗處靜置30 min，以同濃度樣品液作為參比，于波長517 nm處測定吸光度A1，竹蟲蛋白肽清除率按式（1）計算。

1.2.6.2 MTT小鼠肺成纖維細(xì)胞增殖試驗[20-21]

收集對數(shù)生長期的小鼠肺成纖維細(xì)胞，細(xì)胞密度調(diào)整至103~104個/孔，在96孔平底板中每孔加入200 μL，在5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁，加入100 μL不同濃度梯度（0，0.64，3.2，16，80，100和400 μg/mL）的竹蟲蛋白肽，每個濃度設(shè)6個重復(fù)。繼續(xù)在5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)結(jié)束后，用100 μL新鮮培養(yǎng)基更新，內(nèi)含每孔20 μL 5 mg/mL的MTT溶液，孵育4 h顯色。棄去培養(yǎng)液，用PBS清洗2次，每孔加入150 μL DMSO，于37 ℃振蕩培養(yǎng)10 min，使紫色結(jié)晶物溶解，用酶聯(lián)儀測定吸光度（以空白調(diào)零），通過與對照組比較得到試驗組的存活率。各組吸光度取平均值后，細(xì)胞存活率按式（2）計算。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳酶的確定

由圖1可知，利用胰蛋白酶提取竹蟲蛋白肽得率最高，為200.321 mg/g，因此選擇胰蛋白酶為最佳提取酶。木瓜蛋白酶與胃蛋白酶提取的得率較低的原因可能是2種酶的最適pH為酸性，提取蛋白肽的蛋白質(zhì)是通過堿提酸沉法制得的，酸性環(huán)境可能會使蛋白繼續(xù)沉淀，導(dǎo)致酶提效果較弱。

圖1 竹蟲蛋白肽最佳提取酶的確定

2.2 單因素試驗

2.2.1 加酶量的確定

稱取5份1 g竹蟲蛋白粉置于5個燒杯中，分別加入30 mL蒸餾水，調(diào)節(jié)pH 7.68~8.00，分別加入60，70，80，90和100 mg胰蛋白酶，于40 ℃恒溫振蕩60 min。

由圖2可知，隨著加酶量的增多，肽得率呈現(xiàn)先增后減的趨勢，加酶量80 mg/g時肽得率最大，為245.980 mg/g。加酶量增加到一定值時，底物被酶所飽和，底物上可供酶所切割的位點有限，此時進(jìn)一步增加酶量，水解度不會有更大的變化[22]。

圖2 竹蟲蛋白肽提取加酶量的確定

2.2.2 最佳水解溫度的確定

稱取5份1 g竹蟲蛋白粉置于5個燒杯中，分別加入30 mL蒸餾水，調(diào)節(jié)pH 7.68~8.00，各加入80 mg/g胰蛋白酶，分別于30，35，40，45和50 ℃恒溫振蕩60 min。

由圖3可知，竹蟲蛋白肽得率隨著溫度的升高呈現(xiàn)先增后減的趨勢，其中40 ℃時的肽得率最高，為251.260 mg/g，40 ℃是胰蛋白酶的最佳作用溫度，水解溫度的高低與蛋白酶分子的穩(wěn)定性有關(guān)，這是因為蛋白酶分子的肽鍵具有特定的空間結(jié)構(gòu)，如果反應(yīng)溫度太高，會引起蛋白分子的次級鍵進(jìn)行解離，從而使蛋白酶喪失或部分喪失催化活性；若反應(yīng)溫度過低，則會降低體系內(nèi)蛋白分子運動的激烈程度，從而降低底物與蛋白酶的碰撞概率[23]。

圖3 竹蟲蛋白肽最佳水解溫度的確定

2.2.3 最佳水解時間的確定

稱取5份1 g竹蟲蛋白粉置于5個燒杯中，分別加入30 mL蒸餾水，調(diào)節(jié)pH 7.68~8.00，各加入80 mg/g胰蛋白酶，分別于40 ℃恒溫振蕩30，60，90，120和150 min。

由圖4可知，竹蟲蛋白肽的得率隨著水解時間的延長呈現(xiàn)先增后減的趨勢，水解120 min時肽得率最高，為309.019 mg/g，可能是隨著時間的延長，蛋白肽被降解成氨基酸。

圖4 竹蟲蛋白肽最佳水解時間的確定

2.2.4 最佳水解pH的確定

稱取5份1 g竹蟲蛋白粉置于5個燒杯中，分別加入30 mL蒸餾水，調(diào)節(jié)pH至6，7，8，9和10，各加入80 mg/g胰蛋白酶，分別于40 ℃恒溫振蕩120 min。

由圖5可知，隨著pH的升高，肽含量先增后減，pH 8時肽含量最高，為288.314 mg/g，胰蛋白酶的最適反應(yīng)pH是8，過酸或過堿均可以破壞酶的空間結(jié)構(gòu)，引起酶構(gòu)象的改變，使酶喪失活性；pH變化不很劇烈時，酶雖未變性，但pH可影響底物的解離情況，也可影響酶分子活性部位上一些相關(guān)基團(tuán)的解離，從而導(dǎo)致酶與底物的結(jié)合或催化；pH可以影響與維持酶分子空間結(jié)構(gòu)的有關(guān)基團(tuán)的解離，從而導(dǎo)致酶分子活性部位的構(gòu)象變化，進(jìn)而影響酶的生物活性[24]。

圖5 竹蟲蛋白肽最佳水解pH的確定

2.3 竹蟲蛋白肽最佳水解工藝的確定

2.3.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，利用Design-Expert 8.0軟件進(jìn)行試驗?zāi)Ｐ驮O(shè)計，得出表2所示的響應(yīng)面試驗方案及結(jié)果。

表2 響應(yīng)面試驗方案及結(jié)果

2.3.2 模型建立及顯著性檢驗

經(jīng)過對表2的分析，得到竹蟲蛋白肽的多肽得率與加酶量（A）、水解溫度（B）、水解時間（C）、水解pH（D）的二次方程模型：Y=303.67+23.86A+8.56B+12.53C+26.92D+4.23AB+1.85AC-4.43AD+12.00BC+15.71BD-1.81CD-14.42A2-10.01B2-25.49C2-4.31D2。

回歸模型方差分析結(jié)果見表3。肽得率回歸模型顯著性檢驗P＜0.000 1＜0.01，說明兩者二次多元回歸模型極顯著；回歸模型失擬性檢驗P=0.102 2＞0.05，所選肽得率二次回歸模型與實際試驗擬合性充分模型失擬不顯著。多肽得率回歸診斷表明，決定系數(shù)R2=0.995 5，信噪比=32.612。方程的擬合度和可信度很高，可用于竹蟲蛋白肽得率計算。綜上所述，回歸模型擬合程度良好，試驗誤差小，能夠準(zhǔn)確分析和預(yù)測竹蟲蛋白酶解液的蛋白肽得率，說明試驗操作可信度高，具有一定實踐指導(dǎo)意義。

表3 竹蟲蛋白肽含量回歸模型方差分析表

由回歸系數(shù)顯著性表明，各因素對竹蟲蛋白肽提取效果影響的順序為pH＞溫度＞加酶量＞時間。

2.3.3 響應(yīng)面分析

響應(yīng)面與等高線的稀疏程度可直觀地反映加酶量、溫度、時間、pH之間的交互作用對竹蟲蛋白肽得率的影響，等高線呈圓形時表示兩因素交互作用不顯著，而呈橢圓形或馬蹄形時則表示兩因素交互作用顯著[25-26]。

由圖6可以看出，隨著溫度和時間、pH的上升蛋白肽得率明顯增多，說明溫度與時間、溫度與pH的交互作用對竹蟲蛋白肽得率影響顯著。與方差分析結(jié)果一致。

圖6 各因素交互作用對竹蟲蛋白肽得率影響的響應(yīng)面

2.3.4 最佳條件的確定和最佳模型的驗證

回歸模型通過響應(yīng)面法得到制備竹蟲蛋白肽的最優(yōu)工藝條件：加酶量80 mg/g、溫度45 ℃、時間120 min、pH 10.0，蛋白肽得率預(yù)測值為326.277 mg/g；為驗證該模型預(yù)測的準(zhǔn)確性，在此條件下進(jìn)行3次重復(fù)試驗，竹蟲蛋白肽得率為320.215 mg/g，接近預(yù)測值，證明模型可靠。

2.4 竹蟲蛋白肽活性研究結(jié)果

2.4.1 抗氧化活性

由圖7可知，5 kDa＜MW＜10 kDa的竹蟲蛋白肽DPPH自由基清除活性最強(qiáng)，在10 mg/mL時自由基清除活性為66.23%。

圖7 竹蟲蛋白肽抗氧化活性研究

2.4.2 不同分子量段的竹蟲蛋白肽對小鼠肺成纖維細(xì)胞增殖的影響

將不同濃度（0，0.64，3.2，16，80，100和400 μg/mL）的竹蟲蛋白肽分別加入小鼠肺成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h后計數(shù)細(xì)胞增殖情況，如圖8和圖9所示。試驗結(jié)果表明，培養(yǎng)基中添加MW＜5 kDa（3.2，16和80 μg/mL）、5 kDa＜MW＜10 kDa（400 μg/mL）的竹蟲蛋白肽均能顯著促進(jìn)小鼠肺成纖維細(xì)胞的增殖，說明竹蟲蛋白肽具有促進(jìn)小鼠肺成纖維細(xì)胞增殖的活性。

圖8 MW＜5 kDa的蛋白肽對細(xì)胞增殖作用的影響

圖9 5 kDa＜MW＜10 kDa的蛋白肽對細(xì)胞增殖作用的影響

3 結(jié)論

3.1 竹蟲蛋白的制備

按竹蟲粉與無水乙醚1︰30（g/mL）的比例脫脂效果較好，對后期試驗干擾較小。采用堿提酸沉法進(jìn)行竹蟲蛋白質(zhì)的制備，用1.4 mol/L的NaOH溶液于50℃浸提60 min，用10 mol/L和1 mol/L的鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH至竹蟲蛋白等電點（pH 4.4）使蛋白質(zhì)沉淀，冷凍干燥備用。

3.2 竹蟲蛋白肽制備工藝研究

采用堿性蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶進(jìn)行水解，結(jié)果表明胰蛋白酶對竹蟲蛋白肽的水解效果較好。在單因素試驗基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面試驗確定竹蟲肽的最佳水解工藝：加酶量80 mg/g、溫度45℃、時間120 min、pH 10.0，在此最佳條件下肽得率為320.215 mg/g。

3.3 竹蟲蛋白肽活性研究

采用超濾分離得到的不同分子量段（MW＞10 kDa、5 kDa＜MW＜10 kDa、MW＜5 kDa）的竹蟲蛋白肽均具有抗氧化活性，其中，MW＜5 kDa的竹蟲蛋白肽對DPPH自由基清除活性較強(qiáng)，且隨著濃度的增加而不斷增強(qiáng)，肽質(zhì)量濃度10 mg/mL時自由基清除率為66.23%，說明竹蟲蛋白肽具有較強(qiáng)的抗氧化活性；把不同濃度竹蟲蛋白肽作用于小鼠肺成纖維細(xì)胞，結(jié)果表明竹蟲蛋白肽能夠促進(jìn)小鼠肺成纖維細(xì)胞增殖。