螺螄蛋白美拉德反應產物活性的研究

黎海彬 ，羅岸峰，劉勃，潘寧，黃永春，宋賢良

1.廣東雅和生物科技有限公司（清遠 530000）；2.廣西滬桂食品集團有限公司（柳州 545000）；3.廣西科技大學（柳州 545000）；4.華南農業大學（廣州 510642）

在食品加工工業中，食品中的主要營養成分有蛋白質、多糖等大分子物質，而蛋白質、多糖中含有美拉德（Maillard）反應需要的羰基與氨基，同時食品原料經過熱處理過程，食品一般就會發生Maillard反應，結果會給食品帶來良好的色澤與風味。在食品工業領域，肉類調味基料就是采用蛋白質及其肽類物質進行美拉德反應制備。通過美拉德反應獲得的蛋白肽對食品風味及食品的生物活性有良好作用。對于大分子蛋白質來說，不同肽鏈的長度、肽的氨基酸組成成分和氨基酸序列甚至肽鍵的水解度都會對美拉德反應產物的風味和生物活性產生特定的影響，而特殊風味物質的形成、對原材料風味的改善都可以通過特有的Maillard反應獲得[1-3]。

通過Maillard反應改善食品原料風味的不足，生成特殊風味的物質，該技術在食品調味料的制備以及食品風味的改善中都有很多的研究。在食品香精香料的制造以及食品調味基料的制造過程中[4-7]，為增加食品的風味，改良食品的品質結構，往往通過呈味的小分子肽類物質參加反應，從而形成很好的色、香、味的食品。作為廣西柳州特色小吃，螺螄湯料直接影響螺螄粉的風味及營養，制備具有營養功能螺螄粉調味湯料的研究尚未見報道[8-10]。試驗以螺螄為主要原料，通過生物技術手段制備的小分子鮮味肽具有呈味、抗氧化、提高免疫力等功能，可被廣泛應用于保健品、食品等營養與健康產業，以鮮味肽為主要原料開發出的螺螄粉調味湯料，既增加產品風味，又具有營養保健功能，對螺螄粉產業的發展起到促進作用[11-12]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

螺螄蛋白酶解液：螺螄洗干凈，測定螺肉的主要成分；生物酶解螺螄蛋白，料液比1︰2.5（g/mL），酶解pH 6.5，酶解溫度55 ℃，酶解時間6.5 h，采用復合蛋白酶（3 000 U/g）酶解，在93 ℃下滅酶，保持6 min，離心7 min（5 700 r/min），上清液為螺螄蛋白酶解液，備用。

螺螄蛋白酶解液美拉德（Maillard）反應物（實驗室制備）。

鹽酸、氫氧化鈉、硫酸亞鐵、氯化亞鐵、乙醇（分析純，廣東廣試試劑科技有限公司）；水楊酸、過氧化氫（分析純，廣州天一實驗材料有限公司）；菲啰嗪、DPPH（生化試劑，廣州天普生化醫藥有限公司）；葡萄糖、木糖、果糖（均為食品級，廣東煥發生物科技有限公司）。

DL03電子分析天平（上海贊維衡器有限公司）；001D pH計（上海一恒科技有限公司）；DG18-TS高速離心機（廣州吉迪儀器有限公司）；HRD-4電熱恒溫水浴鍋（上海雅程實驗設備有限公司）；Agilent7890A-5975C氣相色譜-質譜儀[安捷倫科技（中國）有限公司]；TU-3200紫外分光光度計（北京普析通用實驗設備有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 螺螄蛋白酶解液Maillard反應產物的制備

根據影響Maillard反應的幾個因素，在螺螄蛋白酶解液中加入相關的反應物，用保鮮膜、牛皮紙包好密封后放入熱反應容器中，按照設定的條件完成Maillard反應，反應完成后，冷卻保存。

1.2.2 Maillard反應產物抗氧化活性的研究

1.2.2.1 測定清除羥自由基的能力[13]

將2.0 mL 4.5 mmol/L乙醇-水楊酸溶液和2.0 mL 4.5 mmol/L FeSO4溶液在試管中混勻，加入2.0 mL樣品和2.0 mL 5 mmol/L H2O2溶液混勻，在38 ℃水浴25 min，蒸餾水作為對照，在520 nm波長處測定吸光度。羥自由基清除率按式（1）計算。

式中：P為羥自由基清除率，%；A0為加入蒸餾水時的吸光度；Ax為加入測試樣品后的吸光度；Ax0為未加入顯色劑時的吸光度。

1.2.2.2 分析研究Fe3+螯合的能力

測定Maillard反應產物對Fe3+螯合的能力[14]。將0.2 mL 5 mmol/L菲啰嗪、0.1 mL 2 mmol/L FeCl3及3.5 mL蒸餾水與1.0 mL稀釋10倍的樣品混勻，在35 ℃水浴15 min后，在550 nm波長處測定吸光度AS。待測樣品的吸光度記為AC，1.0 mL蒸餾水作為空白對照，記為ASB。Fe3+螯合能力按式（2）計算。

式中：ASB為對照物的吸光度；AC為加入待測樣品后的吸光度；AS為加入標準樣品后的吸光度。

1.2.2.3 酶解液中DPPH自由基清除能力的分析研究

測定螺螄蛋白酶解液在Maillard反應后產物對DPPH自由基清除能力[15]。將3.8 mL 0.1 mmol/L DPPH 95%乙醇溶液中加入0.2 mL樣品，混勻后35 min，在530 nm波長處測定吸光度。DPPH自由基清除率按式（3）計算。

式中：A0為空白試樣DPPH 95%乙醇溶液的吸光度；Ai為樣品與DPPH 95%乙醇溶液混合后的吸光度。

1.2.2.4 Maillard反應產物的總抗氧化活性測定

測定螺螄蛋白酶解液在Maillard反應后產物的總抗氧化活性[16]。在2.5 mL 1% FeCl3溶液、2.5 mL 0.02 mmol/L pH 6.6 PBS溶液中加入1.0 mL樣品，混勻，于55℃水浴15 min，加入2.5 mL 10%的三氯乙酸（TCA），混勻，從中取2.5 mL加入0.5 mL 1% FeCl3溶液與2.5 mL蒸餾水，在25 ℃下反應15 min，在710 nm波長處測定吸光度。

1.2.3 螺螄蛋白酶解液Maillard反應后產物中主要風味物質的分析研究

對螺螄蛋白酶解液在Maillard反應后產物中主要風味物質采用氣質聯用分析技術（GC-MS）[17-18]，分析測定其Maillard反應前后的主要揮發性風味物質的變化。

2 結果與討論

2.1 GC-MS分析

螺螄蛋白酶解液Maillard反應前后，溶于醚類的揮發性物質組分及其相對含量的試驗結果見表1與表2。結果表明，在螺螄肉蛋白酶解中檢出29種物質，分別是6種烷烴類物質、3種物質、1種物質、4種醇類物質、5種物質、2種物質和8種酸類物質；分析試驗結果還可以看出，螺螄蛋白酶解液在Maillard反應后產物中先后檢出35種化合物，分別是3種烷烴類物質、2種酰胺類物質、3種吡嗪類物質、2種酚類物質、3種醇類物質、5種酸類物質、8種酮類物質、2種酯類物質和7種醛類物質（見表2）。結果表明，試樣的揮發性組分大幅增加的主要原因是進行Maillard反應。

表1 螺螄蛋白酶解液中揮發性物質的分析

表2 螺螺蛋白酶解液在Maillard反應后產物中風味物質的分析

酸類化合物中苯甲酸在螺肉蛋白酶解液Maillard反應產物中有較高的相對含量。有文獻報道，苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸、纈氨酸等必需氨基酸可以經過生物代謝產生芳香化合物[18-20]；苯丙氨酸的微生物降解及氧化苯甲醛都能產生苯甲酸。苯甲酸有相關的抗菌活性，如對各種細菌、酵母及霉菌具有明顯抗菌功能，對保質期的延長有很大作用。閾值相對高的酸類物質對風味的產生影響不大，可是有相當的輔助作用。吡嗪類化合物因有較低閾值，在Maillard反應過程中，不同的還原糖及不同的pH可能影響到吡嗪類化合物的產生，呈現出螺螄特有氣味與香氣，對螺螄蛋白酶解液Maillard反應有很大的增強香氣的作用。對于閾值低的醛類化合物，在螺螄蛋白酶解液Maillard反應后，醛類化合物的含量增加，從0提高到8.15%，使酶解液產生很好的風味和氣味。3-辛醇是屬于揮發性的醇類，稍帶瓜味[20]，有高含量。酯類物質是醇類物質與羧酸類物質發生酯化反應的產物，能夠對螺螄蛋白酶解液的香味和氣味起到改進和增強作用，因此，能帶給食品多種香味[18]。

2.2 螺螄蛋白酶解液Maillard反應產物抗氧化活性的研究

功能性調味料是具有抗氧化活性的食品風味配料。主要研究螺螄蛋白酶解液Maillard反應產物的抗氧化功能活性，通過以螺螄蛋白酶解液原液與質量分數1.56%的葡萄糖溶液作為對照物進行研究。

2.2.1 DPPH自由基清除率的研究

波長517 nm時，DPPH自由基醇溶液有強的吸收，使用紫外分光光度法測定吸光度以反映褪色程度，其化學原理就是當能清除自由基的物質存在于溶液中時，溶液的顏色會慢慢褪去，可以反映出DPPH自由基的清除能力。圖1是螺螄蛋白酶解液在Maillard反應前、螺螄蛋白酶解液在Maillard反應后及1.56%的葡萄糖溶液經過幾種倍數的稀釋對DPPH自由基清除能力的結果。從圖1可以看出，這幾種試樣對DPPH自由基清除率會隨著螺螄蛋白酶解液原液稀釋倍數的提高而慢慢減少，螺螄蛋白酶解液在Maillard反應前對DPPH自由基清除能力較小，其清除率為37.50%，而1.56%的葡萄糖溶液對DPPH自由基清除能力比前者大，其清除率為50.50%，但是螺螄蛋白酶解Maillard反應液的最大DPPH自由基清除率是81.50%。試驗結果說明，螺螄蛋白酶解液經Maillard反應后，可對DPPH自由基有較大清除能力。

圖1 DPPH自由基清除率與稀釋倍數的關系

2.2.2 Fe3+螯合能力的分析研究

一般情況下，有金屬螯合能力的物質會有某些特定的抗氧化活性，主要因為它們有Fenton反應的產生，而在金屬離子被螯合時會對產生自由基的反應有一定限制。化學反應的原理是：絡合反應會在Fe3+與菲洛嗪試劑中產生，該反應會產生有色物質而幫助分析物質的變化情況，化合物只要和Fe3+螯合完全，溶液的吸光度就發生改變，要反映待測物質與Fe3+螯合能力的程度，可使用紫外分光光度法測定溶液的吸光度，采用吸光度的數據測定Fe3+螯合能力的大小。螺螄蛋白酶解液在Maillard反應前、螺螄蛋白酶解液在Maillard反應后及1.56%的葡萄糖溶液經過幾種倍數的稀釋對Fe3+螯合能力的大小結果見圖2。結果表明，螺螄蛋白酶解原液和螺螄蛋白美拉德反應液對Fe3+螯合能力的大小隨著稀釋倍數的增加而不斷減小，螺螄蛋白酶解液在Maillard反應前對Fe3+螯合能力較小，其峰值是20.02%，螺螄蛋白酶解液在Maillard反應后對Fe3+螯合能力較大，其峰值是45.03%。這說明對金屬的螯合能力，可通過設計特定的Maillard反應來提高其對金屬的螯合能力，同時也使其抗氧化功能活性提高。

圖2 Fe3+離子螯合能力與倍數稀釋的關系

2.2.3 總抗氧化活性的分析研究

評價溶液中抗氧化能力，主要是考察其總抗氧化活性，包括系統中的酶類和非酶類物質的抗氧化功能的疊加[19-20]。圖3是螺螄蛋白酶解液在Maillard反應前、螺螄蛋白酶解液在Maillard反應后及1.56%的葡萄糖溶液經過幾種倍數的稀釋總抗氧化功能活性的分析研究結果。結果表明，螺螄蛋白酶解液在Maillard反應前、螺螄蛋白酶解液在Maillard反應后及1.56%的葡萄糖溶液經過幾種倍數的稀釋這幾種溶液都擁有某些特定的功能活性，螺螄蛋白酶解液在Maillard反應后的抗氧化功能活性峰值是0.751，可能是含硫、氮之類的物質在一定的溫度下形成的緣故。

2.2.4 對羥自由基清除能力的分析研究

能夠生成穩定的化合物同時停止其自身的氧化反應的是一些擁有清除羥自由基能力的化合物[20]。圖4是螺螄蛋白酶解液在Maillard反應前、螺螄蛋白酶解液在Maillard反應后及1.56%的葡萄糖溶液經過幾種倍數的稀釋對羥自由基清除率的分析研究結果。結果表明，螺螄蛋白Maillard反應液對羥自由基清除率的峰值是76.01%，螺螄蛋白酶解原液及1.56%葡萄糖溶液對羥自由基的清除率的峰值分別是29.01%和54.50%，這可能與能提供氫質子的物質在螺螄蛋白酶解液中的數量極少有一定關系。

圖4 羥自由基清除率與稀釋倍數的關系

3 結論

使用GC-MS對Maillard反應產生的風味物質進行分析和研究，結果表明，具有揮發性風味物質的酶解液，其主要成分和含量在Maillard反應前后會有很大不同。特別是產生多種對風味有很大影響的有機化合物，如醛類、吡嗪、酮類及酯類化合物，分析檢測出35種化合物是通過螺肉蛋白Maillard反應產生的。

螺螄蛋白Maillard反應液具有一定抗氧化功能活性，選用最佳工藝條件下制得的Maillard反應液作為研究對象，結果表明：螺螄蛋白酶解液在Maillard反應后的產物對羥自由基的清除率的峰值是76.01%，對DPPH自由基清除率的峰值是81.50%，對Fe3+的螯合能力的峰值是50.01%，說明擁有強抗氧化功能活性的是螺螄蛋白酶解液在Maillard反應后的產物，Maillard反應后的產物總抗氧化功能活性最強，反應產物吸光度的峰值是0.751，顯著超過對照組。