土茯苓和白土茯苓總黃酮的優化提取及抗氧活性的比較

張光林，肖敏，鄭毓安，胡宗禮

韶關學院英東生物與農業學院（韶關 512005）

土茯苓為光葉菝葜科植物Smilax glabraRoxb.的根莖，具有清熱利濕、健脾益胃、補益肝腎等功效，常用于中醫臨床治療肝腎虧虛、脾胃虛弱、水腫等癥狀[1-2]。此外，土茯苓是一種常見的食材，含有豐富的總黃酮、維生素和礦物質，如維生素B1、維生素B2、維生素C、鈣、鐵等，具有促進消化、增進食欲、有利于水腫患者的康復、延緩衰老、保持皮膚彈性和光澤等多種保健作用，因此在食品中有著廣泛的應用前景[3]。

一直以來，在食品藥品質量檢查中常有土茯苓的混淆品，如薯蕷科植物粉萆薢Dioscorea hypoglaucaPalibin的根莖，百合科植物菝葜Smilax chinaL的根莖，百合科植物百合科肖菝葜Heterosmilax japonicaKunth的根莖[4]。不同土茯苓來源、生長環境、采收時間等因素可能會對土茯苓中總黃酮含量和成分產生影響，甚至一些混淆品可能會對患者的健康產生不良影響，因此正確區分土茯苓的混淆品具有重要意義。

試驗采用超聲輔助-響應面法提取土茯苓、白土茯苓根莖總黃酮，并從料液比、提取溶液乙醇體積分數、超聲提取所需時間3個因素優化2種土茯苓根莖總黃酮提取工藝，進一步比較最優提取條件下2種土茯苓提取物總黃酮的抗氧化活性。正確區分土茯苓的混淆品對于消費者的健康有重要保障作用，旨在為土茯苓、白土茯苓總黃酮的提取提供技術指導，為土茯苓綜合利用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

土茯苓和白土茯苓藥材片（安徽省毫州市福碩堂生物有限公司），經鑒定為百合科（Liliaceae）菝葜屬（Smilax）土茯苓（Smilax glabraRoxb.）和百合科（Liliaceae）肖菝葜屬（Heterosmilax）白土茯苓（Heterosmilax japonicaKunth）。

蘆丁標準品、沒食子酸、鄰苯三酚（均為Solarbio）；福林酚試劑（北京天恩澤基因科技有限公司）；抗壞血酸（韶關市天安科技有限公司）；1-二苯-2-苦基肼（DPPH，APExBIO）。

紫外分光光度計（T-UV1810，上海佑科儀器儀表有限公司）；精密天平（GL8201i-1SCN，北京賽多利斯儀器系統有限公司）；離心機（JIDI-16R，廣州吉迪儀器有限公司）；精密型電子天平（ME203，梅特勒托利多科技有限公司）；恒溫水浴鍋（HWS-12，沙鷹科學儀器有限公司）；超聲清洗儀（SK2200B，上海科導超聲儀器有限公司）；多功能粉碎機（800Y，永康市鉑歐五金制品有限公司）。

1.2 土茯苓總黃酮的提取

土茯苓總黃酮的提取采用超聲波輔助乙醇提取法。取一定量干燥的土茯苓樣品，攪拌機打成粉末，用孔徑0.230 mm（65目）過濾篩過濾得到干燥的土茯苓粉，備用。準確稱取1.0 g土茯苓粉末，用乙醇溶液溶解，進行超聲輔助提取，分別以料液比、提取溶液乙醇體積分數、超聲提取時間進行單因素試驗，最終得到土茯苓提取液。

1.3 NaNO2-Al(NO3)3比色法測定土茯苓總黃酮含量

總黃酮含量的測定采用NaNO2-Al(NO3)3比色法。以蘆丁作為標準品，波長510 nm處測吸光度，以吸光度（y）為縱坐標，質量濃度（x）為橫坐標，繪制標準曲線，得線性回歸方程：y=13.36x-0.011 4，R2=0.995 1。利用標準曲線計算樣品總黃酮含量，通過式（1）計算提取物總黃酮得率。

式中：c為經蘆丁標準曲線算出的土茯苓提取液中總黃酮質量濃度，mg/mL；V為提取液總體積，mL；m為稱取的土茯苓粉質量，mg。

1.4 超聲波輔助提取土茯苓化學成分的工藝優化

以乙醇體積分數、料液比、提取時間進行單因素試驗[5-6]，通過單因素試驗優化提取土茯苓總黃酮的條件，應用Design-Expert 12.0軟件，分別設計三因素三水平的響應面試驗，利用響應面試驗結果，確定土茯苓中各化學成分的最佳提取條件。響應面試驗因素水平見表1。

表1 響應面設計因素水平表

1.5 土茯苓和白土茯苓總黃酮對DPPH自由基的清除能力測定

取不同質量濃度（15.625，31.250，62.500，125.000，250.000和500.000 μg/mL）的VC、土茯苓和白土茯苓樣品溶液，溶液中加入等體積DPPH溶液（0.1 mg/mL），混勻，避光反應30 min，于517 nm波長處測定反應體系的吸光度。等體積無水乙醇替代DPPH溶液制備溶劑空白組和等體積無水乙醇替代樣品溶液制備樣品空白組，VC作為陽性對照組。重復3次，根據式（2）計算提取液對DPPH清除率。

式中：A0為相同條件下，等體積DPPH和無水乙醇的吸光度；As為相同條件下，等體積DPPH和樣品溶液的吸光度；Ac為相同條件下，等體積無水乙醇和樣品溶液的吸光度。

1.6 土茯苓和白土茯苓總黃酮對超氧陰離子自由基清除能力的測定

準確量取配制0.05 mol/L的Tris-HCl緩沖液（pH 8.2），在25 ℃恒溫水浴鍋中保溫20 min，加入不同濃度的土茯苓和白土茯苓樣品（質量濃度15.625，31.250，62.500，125.000，250.000和500.000 μg/mL），混勻后加入0.3 mL 25 ℃水浴中預熱后的50 mmol/L鄰苯三酚試液。振蕩搖勻，置于25 ℃恒溫水浴鍋中反應4 min，反應結束后，向試管中加入0.2 mL 6.0 mol/L HCl溶液終止反應。在325 nm波長處測吸光度，記錄數據。以VC作為陽性對照。根據式（3）計算O2-清除率。

式中：A1為相同條件下，鄰苯三酚和樣品的吸光度；A2為相同條件下，鄰苯三酚和蒸餾水的吸光度；A0為相同條件下，蒸餾水和樣品的吸光度。

2 結果與分析

2.1 土茯苓和白土茯苓的鑒別

如圖1所示，所購買的土茯苓（Smilax glabraRoxb.）藥材為干燥切片，表面呈淡紅褐色，粗糙，質地較白土茯苓（Heterosmilax japonicaKunth）更加堅硬，難折斷，粉末較少，水濕潤后有黏滑感。白土茯苓藥材為干燥切片，表面呈黃褐色，粗糙，質地堅硬，有較多粉末，加水濕潤無黏滑感。

圖1 土茯苓和白土茯苓藥材片的直觀圖

圖2 乙醇體積分數、料液比和提取時間對提取土茯苓總黃酮的影響

2.2 單因素試驗對土茯苓總黃酮得率的影響

通過比較乙醇體積分數、料液比和提取時間單因素試驗優化土茯苓總黃酮的提取，得到適宜提取條件：乙醇體積分數70%、料液比1︰30（g/mL）和提取時間30 min，此時總黃酮得率達12.30%~12.86%。

2.3 響應面法分析土茯苓總黃酮的提取

通過響應面法對料液比、乙醇體積分數、提取時間單因素分析，得到提取土茯苓總黃酮試驗方案及結果，見表2。

表2 響應面試驗設計及結果

通過Design-Expert 12.0軟件對表2的數據進行分析，結果如表3所示。結果表明，料液比和提取時間（P＜0.05）對總黃酮提取影響顯著。以土茯苓中總黃酮得率為響應值，經回歸擬合后，得到回歸方程（4）。

表3 方差分析

據方差分析結果，回歸方程描述與響應面值之間的關系時因其模型的P＜0.01（顯著），差擬項檢驗的P=0.224 7（不顯著），R2=0.939 2，表明模型充分擬合試驗數據[5]，該方程是土茯苓中總黃酮得率與提取工藝各參數的合適數學模型，所以，可以利用此回歸方程確定土茯苓中總黃酮的最佳提取工藝。

響應面圖是三維空間中各試驗因子（A乙醇體積分數、B料液比、C提取時間）對響應值的曲面圖，直觀顯示最佳參數及各參數之間的相互作用。圖3展示回歸分析結果，提取時間和料液比對總黃酮得率影響較大，乙醇體積分數次之。回歸分析結果與等高線圖所顯示的圓心處的極值條件一致[5]。表3回歸分析結果也顯示提取時間和料液比對總黃酮的得率影響顯著（P＜0.05）。

圖4 乙醇體積分數、料液比和提取時間對提取白土茯苓總黃酮的影響

通過軟件分析確定最佳黃酮提取工藝：乙醇體積分數72%、料液比1︰34（g/mL）、提取時間33 min，在此條件下由回歸方程（4）算出的理論值為12.80%。根據所得的分析數據進行2組驗證試驗，總黃酮平均得率為12.94%，測定結果穩定，偏差不大，證明該結果合理可靠。

2.4 單因素試驗白土茯苓總黃酮得率的影響

同理通過比較乙醇體積分數、料液比和提取時間單因素試驗優化白土茯苓總黃酮的提取，獲得最佳提取條件：乙醇體積分數70%、料液比1︰40（g/mL）、提取時間40 min，此時總黃酮得率為1.70%~1.92%。

2.5 響應面法分析白土茯苓總黃酮的提取

通過響應面法對料液比、乙醇體積分數、提取時間單因素分析，得到提取白土茯苓總黃酮試驗方案及結果，見表4。

表4 響應面試驗設計及結果

通過Design-Expert 12.0軟件對表4的數據進行分析，結果如表5所示。料液比和提取時間（P＜0.05）對總黃酮提取影響顯著。以土茯苓中總黃酮得率為響應值，經回歸擬合后，得到回歸方程（5）。

表5 方差分析

據方差分析結果，回歸方程描述與響應面值之間的關系時因其模型的P＜0.000 1（顯著），差擬項檢驗的P=0.474 0（不顯著），R2=0.977 7，表明模型充分擬合試驗數據[5]，該方程是白土茯苓中總黃酮得率與提取工藝各參數的合適數學模型，所以，可以利用此回歸方程確定白土茯苓中總黃酮的最佳提取工藝。

根據回歸方程得出不同因子的響應面分析圖及相應等值線圖結果，見圖5。乙醇體積分數、提取時間對總黃酮得率影響較大，料液比次之，表5回歸分析結果也與此相吻合，提取時間、料液比二者對應的P值小于0.05，均達到顯著水平。

圖5 兩因素交互作用對白土茯苓總黃酮得率的響應面圖和等高線圖

通過軟件分析確定最佳白土茯苓黃酮提取工藝：乙醇體積分數74%、料液比1︰39（g/mL）、提取時間43 min，此條件下由回歸方程（5）算出的理論值為1.92%。根據所得的分析數據進行兩組驗證試驗，總黃酮平均得率為1.95%，測定結果穩定，偏差不大，證明該結果合理可靠。

2.6 土茯苓和白土茯苓提取物對DPPH和超氧陰離子自由基的清除作用

通過檢測DPPH和超氧陰離子自由基的清除作用以評價土茯苓和白土茯苓的抗氧活性。標準品抗壞血酸具有較高的清除DPPH和O2-的能力（圖6）。通過計算，樣品質量濃度為15.625，31.250，62.500，125.000，250.000和500.000 μg/mL時，土茯苓總黃酮含量為2，4，8，16，32和64 μg/mL，而白土茯苓總黃酮含量為0.3，0.6，1.2，2.4，4.9和9.8 μg/mL。土茯苓清除DPPH自由基的能力大于白土茯苓，總黃酮含量達到8 μg/ml以上時，其對DPPH自由基的清除作用趨于穩定，達到84%以上（圖6 A）。土茯苓對O-2清除能力大于白土茯苓，總黃酮含量達到32 μg/mL以上時，O2-自由基的清除率穩定在80%以上。結果表明土茯苓和白土茯苓的抗氧活性與總黃酮的含量呈正相關關系。

圖6 土茯苓和白土茯苓提取物對DPPH和O2-自由基的清除作用

3 討論與結論

土茯苓與白土茯苓被廣泛應用于中醫藥和保健食品中，具有較大的市場需求。已報道研究對土茯苓、白土茯苓及易混淆品種從藥材性狀、粉末特征、顯微特征等多個方面進行鑒別[7-12]。以土茯苓、白土茯苓總黃酮含量及抗氧活性為研究對象，探索得到的土茯苓總黃酮最佳提取工藝為乙醇體積分數72%、料液比1︰34（g/mL）、提取時間33 min，總黃酮提取率為12.94%；白土茯苓總黃酮最佳提取工藝為乙醇體積分數74%、料液比1︰39（g/mL）、提取時間43 min，總黃酮提取率為1.95%。李保利等[13]比較普通回流法、索氏提取法和浸漬法提取土茯苓總黃酮，存在過程繁瑣、耗費時間長等情況，總黃酮的最佳得率在10%~12%。喬蕾等[14]以70%的乙醇為提取溶劑，采用加熱回流提取白土茯苓總黃酮，得率為1.19%，相比于加熱回流的方法，試驗采用的超聲輔助法提取白土茯苓的提取效率更高。抗氧化活性試驗表明，總黃酮含量越高抗氧化能力越強，土茯苓比白土茯苓具有更好的抗氧化活性。試驗結果為土茯苓、白土茯苓市場上的鑒別及應用提供一定理論依據。