鹽度對腐敗嗜水氣單胞菌YCR17腐敗特性的影響

朱耀磊，鄭玉茹，張昕昕，孟婷，和朝軍，馬永杰

洛陽師范學院食品與藥品學院（洛陽 471934）

嗜水氣單胞菌屬是一種常見的條件性致病菌，經常分離于各種水體、水產品及其制品中[1-2]。近年來有關嗜水氣單胞菌屬的研究，多側重在其對食品的致腐特性和機理等方面，作為水產品優勢腐敗菌，能夠表達多種腐敗特性，如水解蛋白質、在多種介質表面形成生物膜、運動性、產生生物胺等[3-4]，且不同來源菌株的致腐特性各有差異。

NaCl能夠改變環境滲透壓，對分離自淡水黃河鯉魚的嗜水氣單胞菌產生脅迫。群體感應（quorum sensing，QS）系統在微生物抵抗外界環境變化中起著重要作用，同時也是食品腐敗微生物的重要致腐調控系統[5]。研究表明QS系統對微生物的腐敗特性如生物膜、泳動性、生物胺、TVB-N產生、胞外蛋白酶等具有顯著的調控作用[6]。Zhu等[7]和Li等[8]的報道顯示，腐敗菌的QS系統會受培養條件及環境脅迫的影響而發生變化，進而對細菌的腐敗特性產生影響，因此研究鹽度對腐敗菌QS系統及腐敗性狀的影響對食品加工條件的選擇及其品質控制具有重要意義。

隨著我國對黃河流域生態環境的保護和改善，野生及養殖黃河鯉魚產量將會面臨急速增長，以分離自黃河鯉魚的一株嗜水氣單胞菌A.hydrophilaYCR17為研究對象，探究不同NaCl濃度作用下該菌腐敗特性的變化，為黃河鯉魚腐敗機理和防腐保鮮研究提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

試驗菌株A.hydrophilaYCR17（分離自腐敗黃河鯉魚）；紫色桿菌CV026（C.violaceum026，由大連工業大學侯紅漫教授惠贈）；酵母浸粉、胰蛋白胨、蛋白胨（北京奧博星生物技術有限公司）；結晶紫染液（上海生工生物有限公司）；無水甲醇、無水乙醇、冰醋酸（均購自天津大茂試劑有限公司）；偶氮酪蛋白（上海麥克林生化科技有限公司）；三氯乙酸（天津市科密歐化學試劑有限公司）。

1.2 儀器與設備

RE-52AA旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）；PE Victor Nivo酶標儀（美國珀金埃爾默公司）；Sigma 3-18KS高速冷凍離心機（德國Sigma公司）；UV-2600紫外-可見分光光度計（日本島津公司）。

1.3 方法

1.3.1 鹽度對A.hydrophilaYCR17 AHLs產生的影響

采用報告平板法[9]對嗜水氣單胞菌AHLs產生進行測定。分別將嗜水氣單胞菌接種到不同NaCl濃度（0，0.5%，1%，2%和3%）的LB培養基中，于30 ℃培養至細菌穩定期。取100 mL菌液，用乙酸乙酯萃取法提取AHLs。配制LB固體培養基，當其冷卻至50 ℃左右時，按照1︰10的比例加入過夜培養的CV026菌液，混勻后移取20 mL傾注平板。待平板冷卻后，在平板中央打孔，加入60 μL的AHLs提取液，置于28 ℃下靜置培養24 h。

1.3.2 A.hydrophilaYCR17胞外蛋白酶活性的測定

采用脫脂奶平板法[10]，分別配制15%的脫脂奶粉溶液和1.5%瓊脂溶液，于115 ℃滅菌30 min，冷卻至60 ℃后將脫脂奶瓊脂溶液以1︰1的比例混合制備脫脂乳固體平板，凝固后在平板中央打孔備用。分別取1 mL在0，0.5%，1%，2%和3% NaCl條件下培養至穩定期的A.hydrophilaYCR17菌液，按8 000 r/min離心10 min，收集上清液，用孔徑0.22 μm的過濾器進行過濾，吸取100 μL添加到脫脂乳固體平板中央小孔中，在30 ℃下培養。觀察平板中央的透明酶解區域大小，并測量直徑。

以偶氮酪蛋白為底物測定A.hydrophilaYCR17胞外蛋白酶活性[11]，分別取150 μL上述無菌濾液添加到250 μL 1%偶氮酪蛋白溶液，在30 ℃下水浴1 h，加入1.2 mL 10%三氯乙酸，混勻后，室溫靜置30 min；按8 000 r/min離心5 min，吸取500 μL上清液添加到500 μL 1 mol/L NaOH溶液中混勻，測定其吸光度A440nm，以每小時A440nm增加0.001定義為1個酶活力單位（U），每組試驗重復3次。

1.3.3 鹽度對A.hydrophilaYCR17生物膜形成的影響

將過夜培養至穩定期的A.hydrophilaYCR17菌液分別用含有0，0.5%，1.0%，2.0%和3.0% NaCl的LB培養基1︰100稀釋，取200 μL加入到96孔板中，于30 ℃靜置培養48 h。按照Ye等[12]的方法測定生物膜的含量。

A.hydrophilaYCR17在玻璃表面生物膜形成的測定[9]。將過夜培養的菌液按1∶100比例分別接種到含有0，0.5%，1.0%，2.0%和3.0% NaCl的LB培養基中，分別取2 mL加入玻璃試管（1 cm×10 cm）中，于30℃靜置培養48 h；培養結束后棄去菌液，用10 mmol/L的PBS洗滌3次，加入2.5 mL無水甲醇固定15 min，棄去管中溶液，在60 ℃下干燥15 min。隨后加入2.5 mL 0.1%結晶紫溶液染色15 min，結束后用去離子水洗滌3次，于60 ℃干燥。觀察管壁A.hydrophilaYCR17生物膜的形成情況。

1.3.4 NaCl對嗜水氣單胞菌YCR17泳動性的影響

分別配制NaCl終濃度為0，0.5%，1.0%，2.0%和3.0%的泳動性培養基，滅菌后量取20 mL傾注平板，待平板冷卻凝固后，吸取3 μL培養至穩定期的菌液，加到泳動性平板中央，小心移至30 ℃恒溫培養箱進行培養[13]。

1.4 數據處理

數據處理結果均以“平均值±標準偏差”表示，使用SPSS Statistics 25軟件進行數據統計分析，采用Office Excel 2019和Origin 9軟件進行試驗數據處理和繪圖。

2 結果與分析

2.1 NaCl濃度對A.hydrophila YCR17 AHLs產生的影響

由圖1可知，紫色桿菌在AHLs的誘導下可以產生紫色素使其周圍呈現紫色區域，紫色素蔓延的范圍大小代表AHLs量的多少。圖1顯示，NaCl濃度為0.5%和1.0%時對AHLs的產生有促進作用，而在高濃度NaCl（2.0%和3.0%）作用時，紫色圈直徑減小，AHLs產生受到抑制。

圖1 不同濃度NaCl對A.hydrophila YCR17 AHLs產生的影響

2.2 NaCl濃度對A.hydrophila YCR17生物膜的影響

由圖2可知，在NaCl濃度為0時，A.hydrophilaYCR17生成的生物膜較0.5%和1%時明顯降低（P＜0.05），而當濃度增加到2.0%和3.0%時，生物膜的形成顯著性減少（P＜0.05）。由圖3可觀察到試管底部區域形成紫色圓環，是A.hydrophilaYCR17菌株在試管底部區域形成的生物膜被結晶紫染液染成紫色。表明該菌能夠在玻璃介質表面形成生物膜，在低濃度NaCl作用下，生物膜形成的紫色較深，區域較大，隨著NaCl濃度的增高，紫色區域逐漸減少，顏色變淺，表明生物膜的形成受到抑制，結果顯示A.hydrophilaYCR17生物膜的形成對高濃度NaCl較為敏感。

圖2 不同濃度NaCl下A.hydrophila YCR17生物膜的形成

圖3 不同濃度NaCl下A.hydrophila YCR17生物膜的形成

2.3 NaCl濃度對A.hydrophila YCR17胞外蛋白酶產生的影響

脫脂乳平板檢測結果顯示，0，0.5%和1% NaCl的作用下，胞外蛋白酶的酶解蛋白區域直徑未發生明顯變化，隨著NaCl濃度的增高，水解透明區域逐漸變小，表明該菌的胞外蛋白酶活性受到NaCl顯著抑制作用。

由圖4可知，偶氮酪蛋白法的檢測結果與脫脂乳平板法的測定結果基本呈現相同趨勢，結果顯示A.hydrophilaYCR17的胞外蛋白酶活性在0和0.5% NaCl作用下未發生明顯的變化，NaCl濃度升高到1%時，蛋白酶活性開始下降（P＜0.05），2.0%和3.0%時蛋白酶水解活性明顯降低。

圖4 不同濃度NaCl作用下A.hydrophila YCR17胞外蛋白酶的活性

2.4 NaCl濃度對A.hydrophila YCR17泳動性的影響

由圖5可知，在NaCl作用下，A.hydrophilaYCR17在泳動性培養基表面的擴散區域發生明顯變化，低濃度NaCl下該菌的泳動性較強，隨著NaCl濃度的增高該菌的泳動性半徑減少，區域變小，表明該菌的泳動性受到高濃度NaCl的抑制作用。

圖5 不同NaCl作用下A.hydrophila YCR17的泳動性

3 討論

A.hydrophilaYCR17是一株分離自腐敗黃河鯉魚的主要致腐菌，該菌能夠產生胞外蛋白酶，形成強生物膜，泳動性等腐敗特性，含有群體感應AI-1型腐敗調控系統[14]。在NaCl的作用下，A.hydrophilaYCR17菌株的上述腐敗特性受到明顯的抑制作用，與Jahid等[3]和趙丹丹等[15]的研究結果一致。研究表明，嗜水氣單胞菌的QS系統對腐敗特性具有顯著的調控作用，這種調控作用是以AHLs為媒介實現[16]。AHLs的產生受luxR/I系統調控，AHLs的產生隨NaCl濃度的增加呈現逐漸減少表明luxR/I調控系統也受到抑制，使得生物膜、泳動性和胞外蛋白酶活性等腐敗特性的表達降低[15,17]。并且，NaCl濃度會改變A.hydrophilaYCR17菌株生長環境的滲透壓，可能導致AHLs、胞外多糖及胞外蛋白酶的分泌和釋放受到抑制，進而影響到各腐敗性狀的表達[18-19]。同時，NaCl濃度的增加使得微生物的生存環境受到影響，可能導致細菌為了抵抗外界環境而降低新陳代謝、減少代謝產物的分泌[20]。試驗結果表明，NaCl脅迫下A.hydrophilaYCR17的AHLs產生受到抑制，影響到該菌的QS系統，進而減少對生物膜、胞外蛋白酶產生、泳動性等腐敗特性的調控，造成各腐敗特性的變化。

4 結論

在NaCl脅迫下，分離自腐敗黃河鯉魚的優勢腐敗菌A.hydrophilaYCR17的致腐相關特性、胞外蛋白酶、生物膜、泳動性及群體感應AHLs等均受到明顯抑制作用，初步探究了A.hydrophilaYCR17的致腐機理，在黃河鯉魚的加工和貯藏保鮮的研究中有著重要作用。