基于高通量測序技術的細菌型火鍋蘸料菌群結構研究

連夢瑤，張小慧，馬安妮，李歡，張雪梅，魏俊桃

內蒙古草原紅太陽食品股份有限公司（呼和浩特 011700）

火鍋蘸料以花生醬、芝麻醬、韭菜花醬等多種原料按照一定比例，經過一定加工工藝制成，以其風味濃郁醇香、食用方便快捷、香氣獨特等特點受到廣大消費者青睞。火鍋是流行于全國各地的一種美食，融匯我國各族人民的飲食精華[1]。火鍋蘸料中的花生醬含有豐富的蛋白質、維生素和礦物質等，營養豐富、風味獨特，是很好的佐餐和調味品[2]。芝麻醬做工精細、香味濃郁、口感醇香且營養價值豐富，含有大量優質蛋白質、不飽和脂肪酸、木酚素和維生素E，具有抗氧化、增強免疫力、防病抗癌等功效[3]。韭菜花富含蛋白質、脂肪、糖類等營養物質，同時含有礦物質元素和維生素類物質等有益健康的成分，作為一種北方傳統的調味品，韭菜花醬味道更為濃郁，常作為火鍋配料食用[4-5]。

隨著人們對微生物的認識，更多學者認識到微生物與食品不同風味的形成有重要聯系，高通量測序技術使得食品微生物多樣性研究得以發展[6-12]。馬巖石等[13]基于高通量測序技術分析東北豆醬的微生物多樣性，采用Illumina MiSeq高通量測序技術，對東北市售5種常見豆醬進行細菌16S rDNA V4區及真菌ITS 1~2區基因序列分析，探究其微生物的群落結構組成及其多樣性。董蘊等[14]利用高通量測序技術對6個細菌型豆豉細菌多樣性進行評估，并且建立核心細菌類群與滋味品質相關性的網絡圖，得出葡萄球菌屬（Staphylococcus）和乳酸桿菌屬與豆豉酸味的形成呈正相關。然而，針對火鍋蘸料微生物多樣性的研究少有報道。試驗利用高通量測序方法對火鍋蘸料的細菌菌群結構和組成進行分析比較，以期探索火鍋蘸料中的腐敗菌，實現對蘸料中有害菌的防治，探討加工過程中的工藝合理性和科學性，從而實現提高火鍋蘸料的品質，為提升加工水平以及工藝及設備改進提供科學依據[15-19]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

A1保溫1個月火鍋蘸料，A2更換包材節點多不可計，A3孜然蘸料多不可計，A4當天實驗室自制火鍋蘸料。取150 g左右上述火鍋蘸料樣品，裝入無菌采樣管中，儲存于-20 ℃冰箱備。火鍋蘸料來源為內蒙古草原紅太陽食品有限公司。

E.Z.N.ATM Mag-Bind Soil DNA Kit的試劑盒（OMEGA Bio-Tek公司）；Q10212-Qubit3.0 DNA檢測試劑盒（美國Life Tech公司）；P111-03高保真酶（Vazyme Bio公司）；MagicPure? Size Selection DNA Beads（Transgen公司）；FC-410-1003基因測序試劑盒（美國Illumina公司）。

1.2 儀器與設備

Pico-21-臺式離心機（美國Thermo Fisher公司）；0.5~10 μL微量可調移液器（德國Eppendorf公司）；T100TM Thermal Cyeler-PCR儀（BIO-RAD公司）；Qubit? 3.0熒光計（Invitrogen公司）；Gel-Doc凝膠成像系統（美國UVP公司）；illumina MiSeq高通量測序儀（美國Illumina公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 DNA提取

將不同編號的火鍋蘸料樣品攪拌均勻，根據DNA提取試劑盒說明書，結合SDS裂解液凍融法進行DNA提取，在-20 ℃儲存，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，滿足條帶清晰則進行下一步操作。

1.3.2 測序方法

以火鍋蘸料總DNA為模板進行細菌16S rDNA V3-V4區域擴增。PCR所用的引物已融合Miseq測序平臺的V3-V4通用引物（341F引物：CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGCCTACGGGNGGCWGCAG 805R引物：GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCAGACTACHVGGGTATCTAATCC）進行擴增。DNA模板10 μL，高保真PCR試劑15 μL，前后F/R引物各1 μL（10 μmol/L），dd H2O 30 μL。配制好的PCR體系進行PCR擴增，反應條件：預變性94 ℃、30 min；5個循環為變性94 ℃、30 s，退火45 ℃、20 s，延伸65℃、30 s；20個循環為變性94 ℃、20 s，退火55 ℃、20 s，延伸72 ℃、30 s，終延伸72 ℃、5 min。第2輪擴增，引入Illumina橋式PCR兼容引物，PCR產物（上一輪）20 ng，高保真PCR試劑15 μL，前后F/R引物各1 μL（10 μmol/L），dd H2O 30 μL。配制好的PCR體系按照如下反應條件進行PCR擴增：預變性95 ℃、30 min；5個循環為變性94 ℃、20 s，退火55 ℃、20 s，延伸72 ℃、30 s，終延伸72 ℃、5 min，經過PCR擴增后，通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測文庫大小，使用Qubit 3.0檢測試劑盒對回收的DNA精確定量，按照1︰1的等量混合后測序。等量混合時，每個樣品DNA量取10 ng，最終上機測序濃度20 pmol，在Illlumina NovaSeq 6000 pair-end 2×150 bp平臺進行雙端測序。

1.4 數據處理

使用QIIME（v.1.8.0）軟件對數據進行處理，拆分和截去條碼序列和引物序列后使用Usearch（v5.2.236）對每個樣品的序列進行拼接，得到原始數據，去除嵌合體序列，得到最終的有效數據，默認以97%相似度以上序列聚類成操作分類單元（operational taxonomic units，OTU），使用默認參數挑選OTU的代表序列，基于SILVA128數據庫對代表序列進行物種注釋，進一步生成OTU列表，在各個分類水平上統計各樣本的群落組成，所有樣本中含量低于總序列0.001%的分類單元將被去除。序列數據分析主要使用QIIME和R包（v3.2.0）計算樣品的各項數據指標。使用QIIME軟件計算alpha多樣性指數，通過Chao 1、Shannon、Coverage指數比較每個樣本的OTUs豐度、菌群多樣性；微生物群落組成分析是基于R包中Kruskal方法比較樣本間各分類水平屬的菌群組成結構，通過繪制Venn圖和屬水平分類圖進行分析。

2 結果與分析

2.1 高通量測序序列統計

16S rRNA高通量測序結果通過高通量測序獲得4種火鍋蘸料的有效序列，并對所有有效序列進行Tags聚類分析，在97%的相似度下進行OTUs（Operational Taxo-nomic Units）聚類分析。其中A2和A3獲得最多有效序列，分別為49 619和63 335，A1獲得最少的有效序列。所有樣品經OTU分析共計產生18 770個OTUs。

2.2 序列豐富度及多樣性分析

通過對OTU的聚類和注釋的結果統計，得到不同分類水平上各個樣本的微生物類群組成數量，如表1所示。測序4個樣本共得到142 398條有效數據。Shannon指數和Chao 1指數是衡量物種多樣性和豐富度的指數。Shannon指數越高，表示物種多樣性越大，Chao 1指數越高，表示物種豐富度越高。在4個火鍋蘸料樣品中，A1的Shannon指數為2.43，A2的Shannon指數為2.04，A3的Shannon指數1.89，A4的Shannon指數為3.28。A1的Chao 1指數為14 513.71，A2的Chao 1指數為98 344.66，A3的Chao 1指數為146 864.84，A4的Chao 1指數為22 961.53。經檢驗發現，隸屬于不同火鍋蘸料樣品中的細菌類群在Shannon指數（P＞0.05）、Chao 1指數（P＞0.05）均不具有顯著性差異。由此可見，4個火鍋蘸料中的細菌多樣性和豐富度較為均一。結果表明，4個火鍋蘸料雖然存放條件或時間有所不同，后續儲存過程中可能并未摻雜入大量其他細菌，因此4個火鍋蘸料的細菌類群較為相似。

表1 高通量測序樣品16S rDNA測序情況及分類情況

由圖1可知，在測序深度達到5 000條左右時，所有的Shannon稀釋曲線均已進入平臺期，說明細菌微生物多樣性不會隨之增加。表1中，A3樣本的有效序列數均達到60 000條，A2樣本的有效序列數均達到40 000條，A4樣本的有效序列數均達到20 000條，A1樣本的有效序列數均達到5 000條。Simpson指數代表群落中種數個體分配的均勻程度，Simpson指數越高，群落多樣性越好，可以反映A2和A3樣品中微生物種類豐富，A1和A4樣品中微生物種類少。

圖1 Alpha指數稀疏曲線圖

Rank-abundance曲線是分析多樣性的一種方式。構建方法是統計單一樣品中，每一個OTU所含的序列數，將OTUs按豐度（所含有的序列條數）由大到小等級排序，以OTU等級為橫坐標，以每個OTU中所含的序列數（也可用OTU中序列數的相對百分含量）為縱坐標做圖。Rank-abundance曲線用于同時解釋樣品多樣性的兩個方面，即樣品所含物種的豐富程度和均勻程度。物種的豐富程度由曲線在橫軸上的長度反映，曲線越寬表示物種的組成越豐富；物種組成的均勻程度由曲線的形狀反映，曲線越平坦，表示物種組成的均勻程度越高。由圖2可知，4個火鍋蘸料樣品中物種的豐富程度與均勻程度相差不大。

圖2 Rank Abundance曲線圖

2.3 序列豐富度及多樣性分析

對測序獲得的有效數據進行聚類分析，以97%相似度以上的序列聚類成OTUs，并根據不同類型火鍋蘸料繪制維恩圖（圖3）。A1中含有的OTUs是951，A2中含有的OTUs是6 589，A3中含有的OTUs是8 897，A4中含有的OTUs是3 066。說明4個樣本中的細菌種類A3＞A2＞A4＞A1。A1和A2樣品中相同的OTUs有32個，A1和A3樣品中相同的OTUs有17個，A1和A4樣品中相同的OTUs有105個。A2和A3樣品中相同的OTUs有569個，A2和A4樣品中相同的OTUs有52個，A3和A4樣品中相同的OTUs有22個。4個火鍋蘸料樣品中有13個共有的OTUs，這些微生物起著重要作用。

圖3 4種火鍋蘸料中的OTUs維恩圖

2.4 細菌屬水平上的分布特征

基于屬水平上的分類學對4種火鍋蘸料中最具優勢的11個屬繪制分類圖，如圖4（不同色塊寬度表示不同物種相對豐度比例）所示。A1中主要的細菌類群為黃單胞菌屬（Xanthomonas）、凱斯特鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、未分類菌屬（Unclassified）以及嗜熱嗜堿產芽孢桿菌屬（Caldalkalibacillus），豐度逐個降低；A2中依次為芽孢桿菌屬（Bacillus）、未分類菌屬（Unclassified）、黃單胞菌屬（Xanthomonas）、異桿菌屬（Allobacillus）、凱斯特鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）；A3則主要由芽孢桿菌屬（Bacillus）、未分類菌屬（Unclassified）、異桿菌屬（Allobacillus）、黃單胞菌屬（Xanthomonas）組成；A4中主要的細菌類群為黃單胞菌屬（Xanthomonas）、凱斯特鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、未分類菌屬（Unclassified）、腸桿菌屬（Enterobacter）及嗜熱嗜堿產芽孢桿菌屬（Caldalkalibacillus），豐度逐個降低。A1和A4中均以黃單胞菌屬（Xanthomonas）為優勢菌屬，A2和A3中均以芽孢桿菌屬（Bacillus）為優勢菌屬。秩和檢驗結果顯示，A2和A3火鍋蘸料中芽孢桿菌屬相對豐度無顯著性差異（P＞0.05），表明芽孢桿菌屬細菌類群在A2和A3火鍋蘸料中較為恒定。A1和A4火鍋蘸料中黃單胞菌屬相對豐度無顯著性差異（P＞0.05），表明黃單胞菌屬細菌類群在A1和A4火鍋蘸料中較為恒定。從圖4還可知，4個火鍋蘸料樣本間的菌屬組成存在一定差異性，可能原因為不同存放環境對此類產品細菌群落有一定影響。

圖4 genus水平所有樣本群落結構分布圖

2.5 物種豐度熱圖

物種豐度聚類熱圖分析是通過顏色變化與相似程度反映表格中的數據信息，并呈現群落物種的組成信息，表明火鍋蘸料不同樣品間不同細菌屬的相對豐度及細菌組成的差異性和樣品間的相似性[20-21]。采用物種豐度聚類熱圖分析火鍋蘸料樣品中含量前11個菌屬和4個樣品之間的交互關系，見圖5。不同樣品間屬水平具有一定豐度，且各樣品的菌群組成具有一定差異性和相似性。同時，根據豐度聚類熱圖可以看出樣品間屬水平的聚類關系，即4組樣品均聚在一起，說明4組樣品間的豐度相似，其中A1和A4的相似度較高些，A2與A3的相似度較高些。

圖5 基于屬水平各樣品的物種豐度聚類熱圖

3 討論與結論

采用高通量測序對4種不同處理方式火鍋蘸料的細菌菌群結構，結合豐度聚類熱圖和α多樣性進行分析。測序4個樣本共得到142 398條有效數據，18 770個OTUs。通過高通量基因測序技術，對4種不同處理方式火鍋蘸料微生物的多樣性和豐度進行鑒定，分析火鍋蘸料中可能影響火鍋蘸料品質的菌株，為火鍋蘸料的安全生產提供科學依據。A1中主要的細菌類群為黃單胞菌屬（Xanthomonas）、凱斯特鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、未分類菌屬（Unclassified）及嗜熱嗜堿產芽孢桿菌屬（Caldalkalibacillus），豐度逐個降低；A2中依次為芽孢桿菌屬（Bacillus）、未分類菌屬（Unclassified）、黃單胞菌屬（Xanthomonas）、異桿菌屬（Allobacillus）、凱斯特鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）；A3則主要由芽孢桿菌屬（Bacillus）、未分類菌屬（Unclassified）、異桿菌屬（Allobacillus）、黃單胞菌屬（Xanthomonas）組成；A4中主要的細菌類群為黃單胞菌屬（Xanthomonas）、凱斯特鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、未分類菌屬（Unclassified）、腸桿菌屬（Enterobacter）以及嗜熱嗜堿產芽孢桿菌屬（Caldalkalibacillus），豐度逐個降低。A1和A4中均以黃單胞菌屬（Xanthomonas）為優勢菌屬，A2和A3中均以芽孢桿菌屬（Bacillus）為優勢菌屬。這2種都是腐敗微生物，火鍋蘸料中含量超標會對人體健康產生一定的影響。通過物種豐度聚類熱圖可以看出樣品間屬水平的聚類關系，即4組樣品均聚在一起，說明4組樣品間的豐度相似，其中A1和A4的相似度較高些，A2與A3的相似度較高些。在火鍋蘸料生產中，可根據這些微生物的生存特性對其進行控制，通過鑒定火鍋蘸料中微生物組成，可以在生產中針對性地抑制有害微生物。火鍋蘸料中存在微生物污染情況，并存在致病風險。高通量測序比傳統平板培養微生物更加快速和全面獲得火鍋蘸料中的微生物群落特征信息。本研究實現對火鍋蘸料中有害菌的防治，提升加工水平，為工藝及設備改進提供科學依據，從而實現提高火鍋蘸料的品質。