五布紅柚類胡蘿卜素物質的提取鑒定及焦甜香效果研究

邱光明，周遠祥，朱叢戎，周勝

重慶中煙工業(yè)有限責任公司（重慶 400060）

五布紅柚（Citrus grandisOsbeck cv.Wubuhongyou）又稱五布紅心柚，原產(chǎn)重慶巴縣五布鄉(xiāng)。為選出的地方良種柚，以重慶市栽培為多，廣西、浙江等地也有引種。紅柚中含有豐富的類胡蘿卜素。研究發(fā)現(xiàn)，成熟時期的五布紅柚果實中含有豐富的類胡蘿卜素，紅柚中以番茄紅素為主要呈色色素，不同類型蜜柚類胡蘿卜素的含量存在明顯差異[1-2]。越來越多證據(jù)表明，紅柚中含有豐富的類胡蘿卜素類化合物，具有多種有益效果[3-5]。流行病學證據(jù)表明，攝入高含量類胡蘿卜素類和低含量脂肪酸的食物（如水果和蔬菜）與降低人類疾病如心血管疾病、糖尿病和癌癥等風險直接相關[2, 6-7]。

五布紅柚提取物中的類胡蘿卜素是親脂性的。其結構不同，提取方法各異[8-9]。采用混合提取溶劑，能夠大幅提高提取效率，從而能夠準確進行分析和定量。類胡蘿卜素的檢測方法主要為高效液相色譜法，該方法具有分離效能高、分析速度快、樣品用量少等優(yōu)點，是應用最廣也最適用于類胡蘿卜素物質的分離測定方法[9-11]。

采用靈敏度更高的VWD紫外檢測器的高效液相色譜儀，結合梯度洗脫建立五布紅柚提取物中5種類胡蘿卜素物質的測定方法，并對其精確度、回收率等進行評價；比較不同來源五布紅柚提取物對其5種類胡蘿卜素物質含量及加香效果的影響，以期為五布紅柚提取物果實品質評價和在香精香料中的開發(fā)利用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

Agilent 1260 HPLC系統(tǒng)，配有輸液泵、自動進樣器、柱溫箱、在線脫氣裝置及化學工作站；離心機（科大創(chuàng)新股份有限公司）；200 g 搖擺式高速萬能粉碎機（溫嶺市林大機械有限公司）；電熱鼓風干燥箱（上海一恒公司）；0.45 μm及0.22 μm針頭微孔濾膜過濾器（均購于美國TEDIA公司）；Biocel型密理博超純水系統(tǒng)（美國密理博公司）。

類胡蘿卜素物質標準品：番茄紅素（純度≥99.0%）、β-胡蘿卜素（純度≥99.0%）、玉米黃素（純度≥99.0%）、α-胡蘿卜素（純度≥99.0%）、花藥黃素（純度≥99.0%），均購于Sigma公司，保存在4 ℃黑暗中。

HPLC級甲醇、乙腈和正己烷，丁基化羥基甲苯（BHT，≥99% FG），丙酮（GR級），購自上海Macklin生化有限公司。HPLC級去離子水來自Milli-Q 50系統(tǒng)（西班牙Millipore Iberica S.A.）。將類胡蘿卜素物質標準儲備溶液溶解在二氯甲烷中，用甲醇稀釋至0.1 mg/mL，并在-80 ℃下儲存。0.1，0.5，1.0，10.0，100.0，200.0，500.0和1 000.0 mg/L的類胡蘿卜素物質標準品用于生成測試樣品定量的回歸方程。

1.2 五布紅柚提取物樣品處理

將收獲的五布紅柚在37 ℃下保存72 h，通過AACC 14-50方法測定樣品水分，研磨成細粉。在提取類胡蘿卜素之前，將面粉儲存在18 ℃弱光下，以使降解最小化。

從五布紅柚中提取出類胡蘿卜素。將1.0 g五布紅柚添加到聚丙烯或硼硅酸鹽管中的6 mL提取溶液（丙酮與甲醇7︰3，V/V，0.1% BHTW/V）中，并在渦流混合器中劇烈混合45 s。將混合物在35 ℃、恒溫振蕩器上、弱光下以80 r/min搖動1 h。將提取物在10 000 r/min（4 ℃）下離心10 min。將固體提取殘余物加入到6 mL提取溶液中，搖動并離心。將合并的上清液在氮氣流蒸發(fā)器中于35 ℃蒸發(fā)至干。

將干燥殘余物在3 mL乙醚和3 mL水解介質（50%KOH水溶液和乙醇1∶9，V/V）中重構，并在室溫下黑暗中振蕩2 h。將3 mL水解產(chǎn)物轉移到另一個試管中，并加入3 mL乙醚/正己烷（1∶1，V/V）和3 mL水。將試管在4 ℃下以10 000 r/min離心10 min，用針和注射器除去含有KOH的下層（水相）。有機層在氮氣流蒸發(fā)器中于35 ℃蒸發(fā)至干燥。

將干殘留物加入0.5 mL乙腈/甲醇/正己烷（7︰2︰1，V/V），轉移到1.5 mL試管中，并在10 000 r/min（4℃）下離心5 min。上清液通過0.22 μm過濾器過濾，并儲存在-20 ℃棕色微量離心管中，直至HPLC分析。對于HPLC分析過程中的自動取樣，將50 μL樣品轉移到帶螺旋蓋的琥珀色玻璃瓶中。

1.3 色譜條件及方法評價

使用Infinity Lab Poroshell 120EC-C18柱（4.6 mm×150 mm，4 μm），在Agilent 1260 HPLC系統(tǒng)上進行色譜分析。使用自動進樣器自動進樣50 μm的注射體積和1 mL/min的流速。柱烘箱的溫度分別保持25 ℃。葉黃素在450 nm處被檢測到。流動相為乙腈（A相）、甲醇（B相）和正己烷（C相）。流動相通過超聲處理20 min脫氣。梯度洗脫程序：76%溶液A、21.5%溶液B、2.5%溶液C的初始條件。流動相A的比例在20~22 min內(nèi)從76%線性下降至70%，B在20~22 min內(nèi)從21.5%線性下降至20%。在28~30 min內(nèi)，A相增加到76%，B相增加到21.5%。

5種類胡蘿卜素標準品的5種不同稀釋度用于設置分析條件和確定保留時間。五布紅柚樣品中的類胡蘿卜素通過保留時間進行鑒定，并使用外標法生成的五點校準曲線回歸線進行定量。給出校準線的線性。通過添加類胡蘿卜素標準品來評估準確度，評估類胡蘿卜素添加濃度的回收率。

1.4 加香分析試驗

分別將1.2小節(jié)所得提取液，用丙二醇稀釋到50%質量濃度，混合均勻后，按0.05%的用量，用微量噴霧器分別均勻地噴于成品煙絲50 g上，放入溫度22±1℃、相對濕度60%±2%的恒濕箱內(nèi)平衡24 h，卷制成煙支，由評吸專家小組進行評吸。空白組只加入等量蒸餾水。

2 結果與討論

2.1 色譜分析結果及評價

基于該方法的色譜條件結合VWD檢測器，對5種類胡蘿卜素物質標樣進行最大吸收光譜掃描，掃描波長190~500 nm。分析不同類胡蘿卜素物質的最大吸收光譜，5種類胡蘿卜素物質在450 nm左右均有較大吸收峰，因此，選取450 nm作為類胡蘿卜素物質的定量檢測波長。按照方法提供的液相色譜分離和分析條件，分別精密吸取標準品溶液、重慶巴縣產(chǎn)五布紅柚提取物、廣西賓陽縣產(chǎn)五布紅柚提取物、浙江麗水產(chǎn)五布紅柚提取物、湖南懷化產(chǎn)五布紅柚提取物供試樣品溶液各50 μL，自動進樣器進樣，分析結果如圖1所示。結果表明，在上述色譜條件下，色譜峰尖銳，各相鄰色譜峰之間的分離度均大于1.4，理論塔板數(shù)均大于3 000，滿足類胡蘿卜素物質定量要求。

2.2 色譜分析檢測方法學考察

2.2.1 色譜分析方法線性范圍及檢出限

精密吸取混合標準品溶液，分別稀釋0，5，10，20，50和100倍，吸取上述6種濃度的標準品各10.0 μL進行測定。以各色譜峰峰面積積分值（Y）對其濃度（X）進行線性回歸。結果顯示，5種成分至少在0.02~500 mg/L的線性范圍內(nèi)線性關系良好（r＞0.990 0），檢出限（rSN=3）在0.003~0.03 mg/kg，回歸方程、相關系數(shù)見表1。

表1 類胡蘿卜素物質的線性關系（n=6）

2.2.2 色譜分析方法驗證

吸取50.0 μL標準品，連續(xù)進樣6次，分別記錄5種組分的峰面積，計算得番茄紅素、β-胡蘿卜素、玉米黃素、α-胡蘿卜素、花藥黃素的SRSD（n=6），分別為1.36%，2.46%，3.37%，2.52%和1.77%，表明儀器精密度良好。

取紅柚提取物供試樣品溶液，在0~24 h內(nèi)每隔4 h進樣1次，分別記錄5種組分的峰面積，計算得番茄紅素、β-胡蘿卜素、玉米黃素、α-胡蘿卜素、花藥黃素的SRSD（n=6），分別為3.79%，2.39%，2.49%，3.66%和2.75%，表明供試樣品溶液中5種組分在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

稱取6份紅柚提取物樣品，制備供試樣品溶液，在高效液相色譜下測得番茄紅素、β-胡蘿卜素、玉米黃素、α-胡蘿卜素、花藥黃素的SRSD（n=6），分別為4.25%，3.99%，2.74%，3.95%和2.72%，表明該方法重現(xiàn)性良好。

取6份紅柚提取物（番茄紅素、β-胡蘿卜素、玉米黃素、α-胡蘿卜素、花藥黃素含量分別是316.79，50.81，7.19，6.37和4.03 mg/kg，總計類胡蘿卜素物質含量為221.42 mg/kg），每份2.00 g，精密稱定，置于50.0 mL具塞錐形瓶中，分別精密加入3個不同濃度的番茄紅素、β-胡蘿卜素、玉米黃素、α-胡蘿卜素、花藥黃素標準品（10.0，40.0和80.0 mg/kg），按照前述制備供試樣品溶液，在高效液相色譜下色譜條件下進樣測定，計算回收率，結果見表2。結果顯示，番茄紅素、β-胡蘿卜素、玉米黃素、α-胡蘿卜素、花藥黃素的平均回收率（n=6）在86.39%~105.96%之間，SRSD（n=6）在2.65%~4.30%。

表2 類胡蘿卜素物質檢測加標回收率

2.3 不同產(chǎn)地紅柚樣品檢測結果

分別取上述五布紅柚提取物樣品，制備供試樣品溶液，在高效液相色譜下進樣測定，計算5種組分的含量，結果見表3。

表3 不同樣品類胡蘿卜素物質測定結果單位：mg/kg（以干基計）

從表3可以看出，不同五布紅柚提取物中番茄紅素、β-胡蘿卜素、玉米黃素、α-胡蘿卜素、花藥黃素總含量由高到低為五布紅柚（重慶巴縣）＞五布紅柚（廣西賓陽縣）＞五布紅柚（浙江麗水）＞五布紅柚（湖南懷化）。

2.4 煙絲加香效果

不同來源五布紅柚提取物在煙草中的加香試驗評吸結果見表4。重慶巴縣五布紅柚提取物能與煙香協(xié)調，增加香氣厚實、飽滿度和爆發(fā)力，改善余味，而且能增加焦甜香韻，明顯提升豐滿度和煙氣透發(fā)明亮度。

表4 煙絲加香效果評價結果

3 結論

采用高效液相色譜法同時測定五布紅柚提取物及不同來源得到的五布紅柚提取物中番茄紅素、β-胡蘿卜素、玉米黃素、α-胡蘿卜素、花藥黃素5種類胡蘿卜素物質含量，初步比較不同提取方法對5種類胡蘿卜素物質含量的影響。檢測方法顯示，5種成分至少在0.02~500 mg/L的線性范圍內(nèi)線性關系良好（r＞0.990 0），檢出限（rSN=3）在0.003~0.03 mg/kg，加標回收率在86.39%~105.96%，檢測方法靈敏有效。重慶巴縣產(chǎn)五布紅柚提取物的煙絲加香最為明顯，尤其在增加焦甜香韻方面較為明顯，這與對類胡蘿卜素物質中含量的試驗結果一致。