燕窩真偽鑒別研究進展綜述

邱爽 ，張新科，孔文茹，王姝麒，王東亮

1.北京小仙燉生物科技有限公司（北京 100020）；2.河北省燕窩鮮燉技術創新中心（廊坊 065700）；3.山東大學藥學院（濟南 250012）

燕窩（Edible Bird’s Nest，EBN）原產于東南亞，是由雨燕科金絲燕屬（Aerodramus）、侏金絲燕屬（Collocalia）和雨燕屬（Apus）在繁殖季節分泌的唾液與羽毛、草等混合，粘合在墻壁或者洞穴上而鑄成的“育兒床”，用于產卵及孵育雛燕[1]。能夠產燕窩的金絲燕主要分布在印度尼西亞、馬來西亞、泰國、緬甸、越南、菲律賓、柬埔寨和中國南部[2]。印度尼西亞生態環境適宜，燕屋應用成功，是全球最大的燕窩輸出國，年產量約為全球的85%。

燕窩性平味甘，歸肺經、胃經、腎經，在我國歷史悠久，早在明代就有燕窩記載。現代研究發現燕窩含有豐富的蛋白質、氨基酸、唾液酸和微量元素等[3-4]，具有抗病毒、抗氧化、抗神經退行性疾病及皮膚保護等多種生物功能[5-6]。中國是世界上最大的燕窩消費國，也是每年全球最大的燕窩進口國。僅2021年1月至6月，中國從印尼和馬來進口了約170 t燕窩[2]。燕窩行業附加值高，供小于求，1 kg燕窩在我國的售價高達6 000美元，不少商家通過摻假來牟取高額利潤，以次充好現象更是屢屢發生[7]。消費者們并不能很好地對燕窩真偽及是否摻假進行鑒別。建立一套高效、便捷、準確的燕窩真偽鑒定方法一直是燕窩行業的一大難題。針對目前國內外燕窩摻假方式及真偽鑒別方法進行了匯總，為后續燕窩真偽鑒別研究提供一定的參考。

1 目前燕窩常見的摻假方法

燕窩摻假分為完全造假和部分摻假兩種情況。前者是產品中完全不含有燕窩，將瓊脂、魚鰾、卡拉膠、豬皮、銀耳等摻假物與調和劑混合制成；后者制成的產品中含有燕窩，為了提高產品重量、風味、口感或賣相，在燕窩中混入瓊脂、銀耳、豬皮、蛋清、葡萄糖、卡拉膠等[7-9]。燕窩常見摻假物分為兩類。第一類為魚鰾、豬皮、卡拉膠、珊瑚粉、瓊脂和銀耳等固體，它們附著在燕窩表面，可以利用顯微鏡觀察到表面結構的差異。第二種是水溶性物質，如糖類（葡萄糖、蔗糖）、多肽（水解膠原蛋白）和鹽，在干燥時很容易被燕窩內部吸附形成復合物，使其難以目視檢測[7]。

除了人為摻假外，還有許多商家為了牟取高額利潤，混淆燕窩產區、品種以及生產方式。人們認為天然洞燕的營養價值高于屋燕，燕窩市場便出現了大量將白燕熏制染色成血燕的現象，特別是2011年發生的“血燕”事件，此次食品安全事件的根本原因就是不法商家采購便宜的白燕窩熏制、發酵、染色加工成血燕，這給燕窩行業帶來了嚴重打擊，直到近年才有所恢復[10]。

燕窩摻假事件層出不窮，燕窩行業良莠不齊，使得消費者對燕窩產生信任危機。多數消費者難以對燕窩真偽進行鑒別，開發有效、快速的燕窩真偽鑒別方法一直是重要的研究課題。

2 燕窩真偽鑒別檢測方法

2.1 遺傳學方法

蛋白質分析和DNA分析是食品溯源和真實性分析最常見的方法。DNA比許多蛋白質耐熱，穩定性高，這使其成為區分和鑒定食品成分的首選分子。

在燕窩真偽以及燕窩基源鑒別中，針對特定核酸序列鑒定可以提高檢測的準確度，常見的有線粒體細胞色素b（Cytb）基因和NADH脫氫酶亞基2（ND2）基因。Lin等[11]基于Cytb基因序列，構建了用于燕窩樣本遺傳鑒定的系統發育樹。何國林等[12]設計了一條特異靶向Taq Man探針，通過鑒定金絲燕屬與雨燕屬Cytb基因進行燕窩的真偽鑒別。在該類研究中，DNA的提取效率是實驗的關鍵，研究表明異硫氰酸胍法是燕窩DNA的最佳提取方法[13]，特定序列的檢測降低了全基因檢測中可能出現的假陽性誤差。DNA分析用于燕窩真偽鑒別更準確，可實現燕窩的相對定量。然而DNA技術操作繁瑣，應用于燕窩流通中的真偽鑒別還存在一定的局限。

2.2 酶聯免疫吸附法（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）

ELISA具有免疫反應的特異性和酶標記物檢測的高敏度雙重優勢。豬明膠是食用燕窩中的常見摻假物，為了快速檢測燕窩中的豬明膠，研究針對豬種特異性氨基酸序列的α2 Ⅰ型膠原（pAb 1、pAb 2）與α1 Ⅰ型膠原（pAb 3）鏈建立了競爭性間接ELISA反應，該技術能夠檢測到樣品中至少0.05%的豬明膠[14]。對比3種ELISA反應，pAb 3鏈反應穩定且未與蛋清發生交叉反應，更適合于燕窩中豬明膠的檢測[15]。除了設計摻假物的特異性抗體外，還可以針對燕窩特定成分進行ELISA反應。唾液酸糖蛋白是燕窩中唾液酸的主要載體，由106和128 kda蛋白組成。Zhang等[16-17]利用夾心ELISA法制備了兩種抗特征性唾液酸糖蛋白單克隆抗體，并用Western印跡法檢測，優化后的ELISA條件IC50僅為1.5 ng/mL。ELISA的特異性強，但受到摻假物種類的限制，針對不同的燕窩摻假物需篩選制備出不同的抗體。

2.3 光譜法

燕窩中的唾液酸與酸性茚三酮能形成穩定物質，利用紫外光譜法（Ultraviolet Spectrophotometry，UV）檢測時在470 nm處有最大吸收峰[18]。對于燕窩本身來說，真品燕窩在280 nm處有最大紫外吸收，而偽品無最大吸收峰[19]。核磁共振技術操作簡便、普適性高、異構體分析能力強。高志亮[20]對比了燕窩及摻假物的1H-NMR譜圖，結果發現假燕窩在化學位移δ3.4~4.0未檢測到與唾液酸相似的共振峰，而真品燕窩能檢測到。然而單從指定成分的光譜結果衡量燕窩真偽并不準確，更不能對摻假物的種類和含量做出準確的判別。擴大樣本量結合化學計量學建模是提高準確度的重要手段。Shi等[21]利用近紅外光譜和化學計量學建立了一種快速、簡單的燕窩真偽及分級認證方法。研究從印尼、馬來和泰國共收集了80多種燕窩，制備了200個摻假燕窩，利用化學計量學提取與燕窩品質相關的光譜特征，基于這些光譜特征建立的模型對燕窩真偽、質量分級的識別率可達到90%以上，該方法通過擴大樣本量和來源建立了一套較為準確的鑒別模型。

在光譜相關的鑒別方法上，傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）技術應用于燕窩真偽鑒別在不斷發展。早在2001年，孫素琴等[22]首次將鉆石ATR探頭FTIR技術應用于燕窩鑒別，研究發現各個燕窩紅外譜圖的峰形相似，但部分營養成分吸收峰的強度和位置存在差異，特別是蛋白質、氨基酸和多糖。后續的研究大多利用燕窩及摻假物的FTIR譜圖、特征峰進行分析建模[23]，然而此類模型在摻假物含量較低時判別不準確[8]。

除了燕窩真偽鑒別外，光譜法還可用于血燕的區分。Cheng等[24]通過1H-NMR技術發現燕窩熏制后苯環發生改變，并將燕窩人工硝化過程中SERS指紋圖譜的變化歸因于氨基酸殘基的結構改變[25]，這些研究證明了燕窩熏制過程導致氨基酸序列改變，從本質上實現了對天然血燕和人工熏制血燕的識別。

相比于遺傳學和蛋白學，光譜技術樣品前處理和操作更簡單，通過擴大樣本量聯合化學計量學可以建立一套較為穩定的燕窩真偽鑒別模型。然而該方法無法實現摻假物的定量，對于一些未知摻假原料不能做出準確的判斷，精準度不如其他鑒別方法。

2.4 色譜法

利用色譜技術進行燕窩真偽鑒別多集中在對特定成分定性或定量來區分燕窩中是否含有摻假物。燕窩中單糖組成是燕窩真偽鑒別的重要指標，Tung等[26]采用高效離子交換色譜-脈沖安培檢測器（High-performance anion-exchange chromatography-pulsed amperometric detector，HPAEC-PAD）進行糖譜分析，最終將唾液酸相對含量（10.8%±0.76%）作為評估燕窩含量的指標。此外，真正的燕窩含有甘露糖、半乳糖、N-乙酰基-D-半乳糖胺、N-乙酰氨基葡萄糖和唾液酸，而多數假冒品不含[27]。利用氣質聯機（Gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）、氣象色譜（Gas chromatography，GC）檢測燕窩中揮發性成分、氨基酸、脂肪酸組成也被用于燕窩真偽鑒別、產區溯源以及加工工藝的區分[28-30]。

除單糖組成外，唾液酸含量也是鑒別燕窩真偽、衡量品質好壞的重要指標，液相色譜是檢測唾液酸最常用的方法。不同品種燕窩中唾液酸含量具有差異，如白燕中唾液酸含量為13%，血燕中為10%，而銀耳、豬皮、瓊脂等常見偽品中不含唾液酸[31-32]。唾液酸含量也可以用作燕窩等級劃分的標準，唾液酸含量在10%以上為A級燕窩，7%~10%為B級，5%~7%為C級[21]。該方法在一定程度上可以區分燕窩及摻有銀耳、豬皮等成分的摻假燕窩，然而市場上還有商家直接向燕窩中添加唾液酸或其他含有唾液酸的原料，在此類產品的檢測中以唾液酸為基準的鑒別方法便不準確。此外，現有研究中多認為唾液酸是燕窩的核心營養成分，但唾液酸只占燕窩的10%左右，只以唾液酸含量作為燕窩分級的標準過于片面。在燕窩的營養成分中，50%以上均為蛋白質，特征蛋白或肽段的篩選將成為燕窩真偽鑒別及分級的重要方向。

基于以上研究方向，Wu等[33]篩選出了13個標記肽段用于區分白燕和草燕/摻假物，3個肽段區分草燕與白燕/摻雜物。特異性肽段的篩選可實現摻假物或燕窩的定量。Ma等[34]篩選出了9種來自摻雜物的特征肽段用于摻雜物的定量分析。類似的方法也被用來定量燕窩產品中瓊脂的含量，瓊脂是燕窩常見摻雜物，因其不吸收紫外，很難對燕窩中瓊脂含量進行檢測。Cheng等[35]開發了一種子寡糖標記法對瓊脂進行定性定量。研究利用LC-QTOF-MS檢測發現新瓊四糖信號豐度高且與標準瓊脂線性關系好，被選為檢測標記用于定性和定量分析，這種低聚物標記法可用于燕窩原料中摻有瓊脂產品的質量控制，而且可以定量分析[35]。基于色譜檢測的蛋白質分析方法不僅可以準確地對燕窩及摻假物進行判別，重要的是可實現產品中燕窩及摻假物的定量，具有廣闊的發展前景。

2.5 凝膠電泳法

凝膠電泳常用于蛋白質分析，典型的有聚丙烯酰胺凝膠電泳（Polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）和雙向電泳（Two-dimensional electrophoresis，2-DE）。燕窩往往被加工成長梭形、球形，如白燕條、宮燕餅、草燕等。早在1999年，胡珊梅等[36]就利用PAGE對燕窩及燕窩加工品進行區分，研究通過各實驗樣品在電泳圖譜上譜帶的條數以及深淺進行鑒別，證實了該方法區分燕窩及加工品的可行性。真燕窩比豬皮、瓊脂等燕窩偽品的特征圖譜更明顯，蛋白質種類更多[31]。

電泳技術也被用于燕窩產地及生產方式的區分，郭麗麗[8]采集了來自印尼和馬來的已知生產方式和產區的燕窩，利用蛋白條帶數和相對含量建立了產區和生產方式的判別模型，采用2-DE篩選出了不同生產方式和產地的燕窩差異蛋白點，為后續的質譜分析提供一定的參考。SDS-PAGE結合多變量分析是鑒別燕窩地理來源和生產方式的一種可行方法，然而該方法的檢測精度受到建模時實驗樣本數量和覆蓋率大小的影響，應通過擴大樣本量和樣本來源以驗證鑒別模型的穩定性[37]。

2.6 其他方法

除上述方法外，還有一部分研究利用氨基酸分析儀、傳感器陣列、同位素等方法進行燕窩真偽鑒別。不同燕窩樣品以及摻假物在氨基酸組成和含量上都存在差異，如真品燕窩中不含羥脯氨酸和胱氨酸，偽品在氨基酸組成上和燕窩均不相同[38]。Eric等[39]首次將熱重分析（Thermogravimetry，TG）、微分熱重（Differential thermogravimetry，DTG）和差示掃描量熱分析（Differential scanning calorimetry，DSC）用于燕窩的快速鑒別。燕窩獨特的熱重分析和微分熱重分析曲線可作為燕窩真偽分析標準，該方法只需5~10 mg樣品，無需樣品預處理即可檢查燕窩中是否含有摻假物。

表1 燕窩真偽鑒別技術的應用

Huang等[29]開發了一種由比色傳感器陣列、智能手機和多層網絡模型構成的低成本智能系統鑒別和定量摻假燕窩，通過收集燕窩的揮發性成分特征和響應信號，利用智能手機獲取圖像，該系統提供了一個實時、可靠的預測模型。隨后該團隊用同樣的方法識別燕窩的地理來源，使用PCA、HCA和聚類分析研究樣本組之間的相似性，該設備能夠識別未知燕窩的地理來源[40]。該技術特異性強，但同樣受到樣本量和樣品來源的影響，且并未實現摻假物的定量。

3 結語與展望

燕窩具有眾多保健功效，一直被認為是名貴的滋補品。然而，目前燕窩行業沒有規范的真偽鑒別標準，燕窩產品魚龍混雜，摻假現象頻頻發生，一直是燕窩行業的一大難題。此研究對燕窩常見的摻假物進行匯總，從遺傳學、ELISA、光譜學、色譜學、凝膠電泳學方向歸納了燕窩的真偽鑒別方法，并討論了每種方法的優缺點，為燕窩行業質量監控體系提供參考。

基因和蛋白層面的燕窩真偽鑒別比光譜法以及色譜法中特定成分的檢測更準確，然而金絲燕的基因、蛋白數據庫不完善，現有研究中燕窩的蛋白和肽段數據大部分不具有系統性[33]，急需補充金絲燕及燕窩數據庫，找到真正的差異基因或蛋白。燕窩真偽鑒別常涉及專業儀器和方法，且需要一定的樣品前處理，不利于在進口或商品流通環節推廣。后續還需要開發準確、快捷的燕窩真偽鑒別方法，將其與成熟的計量學分析手段結合，適合于流通環節的使用。

此外，燕窩造假事件導致的食品安全問題不容忽視。許多生產商為了延長即食燕窩的保質期，使用次氯酸鹽漂白燕窩，抑制細菌生長。該過程會形成氨基脲，危害消費者的健康[47]。然而目前對漂白燕窩的鑒別方法十分有限，大多僅從味覺以及觸覺等感官層面上區分，沒有準確的衡量標準，仍需要更深入的研究。