基于不同基質純化重組蛋白的研究進展

張飛飛，朱睿，姜學權，胡俊毅，方逸超，汪浩勇

湖北工業大學生物工程與食品學院（武漢 430068）

近年來，重組蛋白用于晶體學研究、免疫學特性探究、酶學和醫學應用（如藥物蛋白）及蛋白質特性（如功能、活性和結構）的一般性研究[1]。重組蛋白的生產和純化密切相關，蛋白質生產宿主的選擇不僅影響蛋白質的擴增和分離，而且影響純化產物的方式，基因工程技術的不斷進步增加宿主細胞，如細菌、哺乳動物、昆蟲和酵母等中生產的大量重組蛋白的可用性，其中大腸桿菌仍是最廣泛使用的菌株[2-3]。然而，在重組蛋白質純化過程中依然要克服許多技術難題才能獲得高質量的蛋白質樣品，滿足既定的純度和構象要求，這對重組蛋白的純化和表征可能要求高、昂貴且耗時，但可以確定蛋白質的質量，因此，重組蛋白的成功應用很大程度取決于其高效的下游加工，包括蛋白質純化、質量驗證、量化和儲存等條件[4]。

蛋白質工程功能材料的應用前景十分廣闊，在固體材料和生物元素之間建立特定的非共價/共價相互作用的顯著能力，促進定制和先進功能材料的開發，以及下一代雜交材料的應用。在蛋白純化過程中標簽介導的重組蛋白可與多種材料結合，最適合用于蛋白質純化過程，因此獲取高質量的蛋白質樣品被運用于各個領域。主要綜述有關蛋白質純化過程中基于不同基質材料對目的蛋白的純化最新研究進展。

1 重組蛋白標簽的概述

目前，有許多蛋白質表達的系統，例如大腸桿菌、畢赤酵母等可以為各種肽和蛋白質提供對應的表達宿主，最終將目的肽或蛋白純化出來進行研究。因此，從其他細胞內容物中快速且經濟地純化活性生物重組蛋白被認為是生物技術領域的最大挑戰之一，通過將遺傳序列與親和標簽整合，可以促進目標蛋白或酶的純化。在這種情況下，目標蛋白質的標簽和蛋白質作為單個單元表達，并且可以通過標簽純化方法從其他細胞內容物中分離蛋白質。親和標簽通常被廣泛用于試驗研究，因為它們應用廣泛，親和標簽的重要限制之一是標簽對蛋白質的自然功能、其物理化學性質及后續應用的意外影響，所以目標蛋白純化后的標簽分離必不可少，雖然該過程是通過特定的內肽酶完成，但隨之而來的成本阻礙該技術的大規模應用。此外，應用的內肽酶應在分離過程中與蛋白質分離，進一步增加勞動力成本并阻止這些標簽在工業規模上的應用[5]。

使用不同重組蛋白標簽可對重組蛋白有不同的回收效果，在生化蛋白方面，其主要作用是提高蛋白質產物進入高質量水平，抑制蛋白質水解反應，促進目標蛋白的折疊過程，保護抗原性集成蛋白，增強蛋白質的溶解度，以及提高單鏈抗體標記結合技術的敏感性。但是重組蛋白標簽缺點是影響修飾目標蛋白構象（蛋白質的溶解度和活性），降低蛋白質產品的可用性，由于最終切割過程中的缺陷，抑制酶活性，改變蛋白質的生物活性，結構研究混亂造成不必要的蛋白質靈活性，最后分離標簽是昂貴的[5]。因此，快速、可靠、高性價比的重組蛋白分離純化技術是生物技術和生物醫學領域的重要前提，獲得高產、高純度和高活性的重組蛋白對于下游不同和多種應用是必不可少的[6]，尤其在蛋白質純化過程中標簽的類型、大小和位置是至關重要的選擇標準。

1.1 標簽類型

在重組蛋白標簽可根據性能分為兩大類。一是溶解度標簽。這些標簽增加了目的蛋白的溶解度，提高了靶蛋白表達和穩定性，這種類型的標簽主要有GST、MBP、NusA、Trx和SUMO等。二是親和標簽。這些標簽使用結合親和基質捕獲目標蛋白，主要有Poly、His、Flag、HA、Strep II、CBP1、CBD2等。在單獨使用結合親和標簽就足以表達完全可溶性，Histag仍是使用最多的親和標簽，無論作為單個標簽，還是作為非傳統串聯親和凈化標簽的靶向目標[7]，它在蛋白質檢測和結晶方面的效果已得到很好證實[8]。然而，它可以干擾蛋白質的結構及功能屬性，為解決不溶性問題，親和性標簽有時也可作為溶度增強劑使用，但對于溶解度低或表達水平低的蛋白質，應同時使用可溶性標簽和結合標簽以實現蛋白質的正確表達和純化。如可通過谷胱甘肽和直鏈淀粉樹脂有效地使用結合親和力標簽純化MBP和GST融合蛋白。

1.2 標簽尺寸

通常選擇小標簽是為了不容易影響目的蛋白的折疊、生物活性和免疫原性。然而，較大的標簽由于其強烈的翻譯啟動信號，可以提供更高的蛋白質生產水平，此外，如果目標蛋白體積較小，如多肽，則選擇大標簽以防止宿主表達問題[9]。所有的蛋白質標簽，無論大小，都可能對蛋白質的生物學功能、理化性質的改變、免疫和防止蛋白質結晶產生干擾作用，因此標簽的開發必須在蛋白質純化的最后階段進行，這種整合過程一直被認為是蛋白純化成功的關鍵，這個問題的重要性在于蛋白質的大規模生產，去除與蛋白質結合的標簽的成本就會越來越大。融合蛋白標簽的分離主要有3種方法，即化學法、酶法和自切割標記，標簽大小也取決于蛋白質的整體構象[1,10]。

1.3 標簽的位置

編碼N或C端序列的基因與靶蛋白結合并最終與靶蛋白表達，通過融合標記與靶蛋白分離純化[11]。第一步是純化與標簽合并的蛋白質，通過一系列蛋白酶從目標蛋白中分離出標簽，該技術簡單可靠，可用于目的蛋白的純化，目的是保持蛋白質的自然特性。而蛋白質的N端/或C端要想進行標記，需要通過使用密切相關蛋白質的解析結構作為結構模板的基于同源性的建模來進行評估，融合蛋白連接物可用于提高純化標記的可及性[12]。也可以使用較大的標記代替較小的標記，同時顯著提高其溶解度和穩定性[13]。如果游離的（天然的）N端是蛋白質活性的決定因素，則應選擇C端作為標記位置。或者，由于C端標記更有利于高效表達，標簽可以放置在這一端，用蛋白酶裂解，在蛋白質的N端不留下任何或少量附加殘基，因此可以考慮作為一種成本更低的標簽去除方式，標簽及其裂解對蛋白質特性的影響應該通過功能和結構分析評估[7]。

表1 來自不同蛋白質純化/固定化純化標簽

2 基于不同基質純化標簽蛋白

蛋白質純化/固定標簽可以在固體材料和生物元素之間建立特定非共價/共價相互作用的顯著能力，促進對先進的功能材料及下一代混合材料的創造。親和標簽可與多種材料（合成、天然或混合）結合，最適合蛋白質純化。已報道過的基質材料有基于金屬和非金屬材料為基質純化標簽蛋白、基于碳基材料純化標簽蛋白、基于聚合物/多糖材料純化標簽蛋白、基于復合材料純化標簽蛋白。其中，共價結合標簽最適合長期固定蛋白質，但只能與蛋白質材料自然結合。混合親和共價結合標簽允許高效的一步純化和將蛋白質固定在不同材料上，以及開發創新的蛋白質工程材料。自聚集標簽與其他標簽組合特別有用，可用于生成具有自組裝、柔性、響應特性的蛋白質工程材料。雖然這些標簽主要被探索用于獨立的蛋白質純化、固定化或功能化目的，將標簽介導的純化和固定化、功能化結合在一個步驟中的有效策略對于保證先進蛋白質工程材料的可持續制造至關重要。親和肽標簽被證明對固定化/純化過程非常有用，并有望通過從其他污染物中一步回收重組蛋白作為黏附單元[34]。許多可用的親和標簽可與目標蛋白融合以提供親和力，從而推動目標蛋白固定到基質上。

2.1 基于金屬和非金屬材料為基質純化標簽蛋白

常見的金屬和非金屬材料純化標簽蛋白的基質主要分為2種，即未改性的二氧化硅和裸氧化鐵顆粒，2種材料都在生物技術和生物醫學方面廣泛應用。

二氧化硅低成本，易于提取或合成，純度非常高且可重復使用，地球資源豐富且生態友好型的一種基質材料，可成為蛋白質純化/固定化方案最佳選擇之一，由于表面的硅醇基團使其表面非常通用，可用于表面化學修飾，該類特性的材料正被高度開發為替代基質，從而為新的下游加工策略鋪平道路[35]。已報道利用二氧化硅為基質純化目的蛋白的有通常利用綠色熒光蛋白（GFP/EGFP）[33,36-37]作為靶蛋白（圖1 SiO2純化目的蛋白示意圖），以His6、Car9、SB7、R5等標簽純化熒光蛋白，通過該基質提高目的蛋白的回收率及純度。還利用轉肽酶分選酶A（SrtA）通過LPXTG分選信號規范識別底物，被用于介導蛋白A在二氧化硅和石墨烯上的單步純化和定向固定用親核供體基團功能化的氧化物納米顆粒，更好純化目的蛋白[38]。

圖1 以Sio2為基質純化帶有His6標簽的蛋白，通過吸附、分離、洗滌等步驟回收目標蛋白示意圖[35]

裸氧化鐵顆粒低成本，通常由磁鐵礦、磁赤鐵礦、介于兩者之間的過渡態或兩種材料的混合物組成，必須在20~30 nm范圍內才能具有超順磁性[39]。文獻報道的利用裸氧化鐵顆粒純化目的蛋白以綠色熒光蛋白（GFP）[20,39]、重組大腸桿菌物素連接酶[40]、ω-轉氨酶[41]、革蘭陽性細菌巨芽孢桿菌產重組蛋白A[42]、生物素蛋白連接酶（BPL）與其生物素化的底物蛋白生物素羧基載體蛋白[43]作為靶蛋白，通過His6、Glu6、Q6等標簽將蛋白固定在裸氧化鐵顆粒對目的蛋白進行純化回收，同樣提高目的蛋白的回收率及回收的純度。

2.2 基于碳基材料純化標簽蛋白

碳基材料主要通過非共價相互作用，屬于單步功能化材料，已報道有關碳基材料純化蛋白的文獻較少，Díaz-Ayala等[25]將重組HbI與聚賴氨酸標簽Lys6融合，用于在2個碳納米管換能器表面（即粉末和垂直排列的碳納米管）上的特定位點共價固定，固定方式是通過2個步驟實現：一是從表面的羧酸基團生成胺反應性酯，二是將這些基團與Lys-tag的胺基團偶聯，因此純化目的蛋白。Tao等[44]使用不同的條件和技術分析固定化過程，以區分蛋白質共價連接和物理吸附，即描述一種新穎的二維層狀材料（2DLM）剝離和功能化一步策略，以促進2DLM的生產和性能，基于生物相關和分子吸附的實際應用，該方法對溶解在疏水蛋白水溶液中的2DLM進行超聲處理，在此過程中，疏水蛋白滲入夾層并自動結合到2DLM的表面，從大塊材料中剝離單層/少層，剝離的2DLM自發包裹著致密有序的疏水蛋白單層，形成獨特的生物納米復合材料，具有大幅增強的生物相容性和分子吸附能力。Qafari等[38]還通過化學修飾的二氧化硅和氧化石墨烯（GO）納米粒子上的短C末端連接區域，展示分選酶A轉肽反應的特異性對蛋白A作為模型蛋白的共價和定向附著的應用，這種結合可在多種環境條件下發生，而不需要額外的化學反應。

2.3 基于聚合物/多糖基材料純化標簽蛋白

已報道有關聚合物/多糖為材料純化蛋白的材料眾多，大多數聚合物是以樹脂為載體對目的蛋白進行純化，如Khairil等[45]和Keeble等[46]利用SpyDock樹脂，通過合理的工程設計，可以捕獲SpyTag標簽融合并允許高效洗脫目的蛋白。葡聚糖凝膠G-100樹脂也是一種聚合物材料載體，Wu等[18]利用葡聚糖結合結構域將工程鏈霉親和素固定到葡聚糖凝膠上的生物偶聯方法，具有可逆生物素結合能力的工程化鏈霉親和素（SAVSBPM18）已成功應用于純化生物素化和鏈霉親和蛋白結合肽（SBP）標記的蛋白質，產生的親和柱有效地純化SBP標記的和生物素化的蛋白質。Im7樹脂是一種典型的標簽介導的單步純化蛋白質工程先進材料，Vassylyeva等[6]通過Im7樹脂基質材料，通過突變CE7標簽構建CL7標簽，采用的方法就是一步純化復雜蛋白質的高效超高親和層析，由于蛋白質純化需要一個高效的凈化標準，因此，該標簽保持與Im7的完全結合的親和力。肝素瓊脂糖樹脂和Im7樹脂有相似之處，都是采用親和層析，親和層析是純化在不同表達宿主中表達的重組蛋白的一種廣泛使用的方法[47]，AlfA選擇樹脂同樣是一種蛋白質工程先進材料，它的特點源自設計標簽的廣泛性，G?tzke等[14]利用納米抗體結合來自天然或固定標本的ALFA標簽蛋白，具有低皮摩爾親和力。另外，利用多糖為基質純化目的蛋白主要包括纖維素、殼聚糖及淀粉。纖維素是最豐富的植物細胞壁多糖，其解構需要大量微生物酶的協同作用。Pires等[48]利用的模塊化纖維素酶包含非催化A型碳水化合物結合模塊（CBM），A型CBM標簽在纖維素回收中起關鍵作用，含有特異性結合纖維素的結晶區域，從而通過接近和靶向效應提高酶的功效。

2.4 基于復合材料純化標簽蛋白

復合材料是基于納米或分子尺度上對蛋白進行固定純化，被廣泛應用于生物技術、生物醫藥等方面。目前報道與復合材料結合的標簽主要以His6及SBP、CBM等。如甲基汞（MeHg）化合物可以自然形成，具有劇毒，某些細菌已經進化出能夠耐受甲基汞的機制，因此，Mccarthy等[49]通過對甲基汞化合物進行去甲基化，從質子分解反應中由單一有機汞裂解酶控制的去甲基化機制的啟發，使用產生這種裂解酶的重組基因加上選擇性結合沸石顆粒的額外多肽SBP，有效地將酶束縛在固體基質上。Zhou等[50]合成一種高效便捷的用于純化和固定His標記的β-葡萄糖苷酶的Fe3O4/PM-G/IDA-Ni2+納米顆粒，采用蒸餾-沉淀聚合法合成核/殼微球，用亞氨基二乙酸（IDA）打開微球殼上的環氧環以結合Ni2+（圖2），固定化的β-葡萄糖苷酶可多次循環利用，并保留原有活性的65%以上，該材料在酶的純化和固定化方面顯示出巨大潛力。Dhar等[51]利用一種仿生復合材料，該復合材料使用基于彈性蛋白的雜化蛋白聚合物，具有用于還原氧化石墨烯（RGO）和納米原纖化纖維素（NFC）的選擇性結合順序，融合蛋白的黏合和彈性結構域，顯示出協同效應，同時提高合成珍珠層的強度和韌性，用于工程蛋白質的生物合成途徑，為開發具有所需特性的材料提供新前景。

圖2 基于Fe3O4/PMG/IDA納米材料的制備及其結合蛋白示意圖[50]

3 結語與展望

蛋白質工程材料的出現對蛋白質純化過程提供參考，可認為是一種材料科學的未來。基于感興趣的肽、蛋白質特異性連接到有機或無機材料表面的標簽的單步純化和固定方法為一系列不同的新型蛋白質、肽應用開辟了道路，通過該方法，在蛋白質純化過程中蛋白質標簽是關鍵，并顯示出在基于錨肽、蛋白質純化技術方面的巨大潛力，它們可單獨使用，或與其他肽或蛋白質結合，作為共價或非共價接頭用于材料表面功能化，而不影響材料的性質或干擾融合伴侶。開發此類材料所需的蛋白質、肽的可持續供應依賴于重組蛋白質的生產及在過去幾年中已顯著發展的純化和固定化技術，標簽介導的蛋白質純化、固定化策略成為傳統化學固定化方法的環保且具有成本效益的替代方案，允許在一個步驟中將蛋白質、肽結合純化和固定化到天然、合成或雜合材料上，簡化蛋白質工程材料的制造過程，因此，基于不同基質材料純化重組蛋白的方案有待進一步深入探索。