QuEChERS-UPLC-MS/MS法測定豆芽中15種喹諾酮類藥物殘留

張汝凡，閆瑛楠，鄭婕

河南省食品和鹽業(yè)檢驗技術(shù)研究院（鄭州 450003）

豆芽是我國的一種傳統(tǒng)食材，因其營養(yǎng)豐富且價格低廉深受消費者喜愛[1-2]。然而豆芽在培育的過程中極易受到各種微生物的侵蝕，其中以克雷伯菌屬和埃希菌屬的數(shù)量最多[3]。為防止豆芽腐敗，部分生產(chǎn)者會在生產(chǎn)運輸中添加喹諾酮類抗生素。喹諾酮是一種廣譜抗菌藥，其效用明顯且價格相對較低，能夠有效抑制細(xì)菌內(nèi)的脫氧核糖核酸旋轉(zhuǎn)酶的活性，使其無法做到正常分裂，從而達(dá)到殺菌作用[4-5]。有研究表明，長期食用含有喹諾酮類藥物殘留的食品會導(dǎo)致相關(guān)藥物在人體內(nèi)蓄積，可能會造成食用者消化系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)及消化系統(tǒng)（消化系統(tǒng)改為肝腎心臟）等產(chǎn)生不良反應(yīng)[6-7]，同時也會導(dǎo)致人體的耐藥性變強，進而影響相關(guān)疾病的治療效果[8-11]。因此，為保障消費者的健康和安全，開展豆芽中喹諾酮類藥物檢測非常有必要。

針對豆芽中的喹諾酮類藥物的檢驗方法以高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法為主[12-15]，前處理方法有液液萃取法[16]、固相萃取法[17]和QuEChERS法[18]等，但是這些方法都存在不同程度的問題。QuEChERS法作為一種廣泛用于農(nóng)產(chǎn)品檢測的新型快速前處理技術(shù)，對樣品中的蛋白質(zhì)及脂類去除效果明顯[19-23]。試驗旨在建立一種快速便捷的QuEChERS檢測方法，為豆芽中喹諾酮藥物殘留的風(fēng)險監(jiān)測提供更加高效精準(zhǔn)的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豆芽，從鄭州市各大市場、超市隨機抽取。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：恩諾沙星（enrofloxacin，CAS號：93106-60-6）、環(huán)丙沙星（ciprofloxacin，CAS號85721-33-1）、諾氟沙星（norfloxacin，CAS號70458-96-7）、達(dá)氟沙星（danofloxacin，CAS號112398-08-0）、培氟沙星（pefloxacin，CAS號70458-92-3）、沙拉沙星（sarafloxacin，CAS號98105-99-8）、氧氟沙星（ofloxacin，CAS號82419-36-1）、奧比沙星（orbifloxacin，CAS號113617-63-3）、雙氟沙星（difloxacin，CAS號98106-17-3）、氟羅沙星（fleroxacin，CAS號79660-72-3）、依諾沙星（enoxacin，CAS號74011-58-8）、司帕沙星（sparfloxacin，CAS號111542-93-9）、氟甲喹（flumequine，CAS號42835-25-6）、噁喹酸（oxolinic acid，CAS號26893-27-6）、洛美沙星（lomefloxacin，CAS號98079-51-7），質(zhì)量濃度均為100 μg/mL，純度均為100%，天津阿爾塔科技有限公司。甲酸、乙腈（質(zhì)譜純，德國默克公司）；試驗用水為Milli-Q超純水；氯化鈉（天津科密歐化學(xué)試劑有限公司）；乙二胺-N-丙基硅烷（PSA，Biosun有限公司）；無水硫酸鎂（MgSO4，天津大茂化學(xué)試劑廠）；十八烷基硅烷（C18，上海安譜公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜儀（Agilent 1290-6470，安捷倫科技有限公司）；電子分析天平（ME204，梅特勒托利多科技有限公司）；高速冷凍離心機（SIGMA 4-16KS，德國SIGMA公司）；振蕩器（MV-3000，北京萊譜科技有限公司）；渦旋混合器（WH966，上海康華生化儀器制造有限公司）；超聲波清洗器（KQ-500TDB，昆山超聲儀器有限公司）；全自動氮吹儀（ORGN-EVAP24，美國Organomation公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品前處理

稱取5 g（精確至0.001 g）豆芽樣品置于50 mL塑料離心管中，加入混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入10 mL 1%甲酸乙腈溶液，加入5 g氯化鈉，渦旋混合1 min，超聲提取15 min后，以10 000 r/min離心5 min，上清液轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，殘渣用10 mL 1%甲酸乙腈溶液同法重復(fù)提取1次，合并2次上清液，充分混勻，待凈化。吸取5 mL上清液于QuEChERS提取凈化管中（含100 mg MgSO4+100 mg C18），劇烈振蕩2 min，以10 000 r/min離心5 min，精密吸取2 mL上清液于10 mL離心管中，在40 ℃水浴中氮氣吹至近干，殘渣中加入1 mL 20%乙腈水溶液，渦旋溶解，過0.22 μm有機濾膜后，供高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜儀測定。

1.3.2 基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別準(zhǔn)確吸取15種喹諾酮類標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)各100 μL于同一10 mL容量瓶中，用乙腈稀釋并定容至刻度，振蕩搖勻后，作為混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于-20 ℃避光保存。選擇豆芽空白樣品進行提取、凈化等前處理，得到空白基質(zhì)溶液。準(zhǔn)確吸取一定量的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用豆芽空白基質(zhì)溶液將混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液稀釋成質(zhì)量濃度為1，2，5，10，20和50 ng/mL的系列基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3.3 色譜條件

色譜柱Agilent Eclipse XDB-C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流速0.3 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量2 μL；流動相A為0.1%甲酸水溶液，B為乙腈，流動相梯度；洗脫條件見表1。

表1 流動相梯度洗脫條件

1.3.4 質(zhì)譜條件

離子源采用電噴霧離子源（ESI），正離子掃描；氣簾氣壓力（CUR）5 psi；電噴霧電壓（IS）4 000 V（正離子模式）；離子源溫度（TEM）340 ℃；質(zhì)譜掃描方式采用多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）；15種喹諾酮類藥物的質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表2 15種喹諾酮類藥物的質(zhì)譜參數(shù)

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Office Excel 2007軟件進行數(shù)據(jù)處理與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶劑的選擇

文獻報道的前處理方法中，抗生素選用較多的提取溶劑有甲醇、乙腈、酸化乙腈和EDTA-Mcllvaine緩沖溶液等。與甲醇相比，乙腈具有較低的基質(zhì)干擾效應(yīng)，易于沉淀蛋白，更容易通過鹽析從水相中分離出來，對于喹諾酮類藥物而言，酸性提取劑可以提高目標(biāo)物的離子化效率，促進[M+H]+峰的形成，提高質(zhì)譜響應(yīng)并改善峰形，回收率也會有所提升[19]。所以試驗考察乙腈、1%甲酸乙腈、1%乙酸乙腈、EDTAMcllvaine緩沖溶液4種試劑作為提取溶劑進行前處理提取。經(jīng)前處理試驗驗證，EDTA-Mcllvaine緩沖溶液提取出的溶液混沌度高，經(jīng)高速冷凍離心后樣品基質(zhì)與提取液仍不能進行有效分離，可見EDTA-Mcllvaine緩沖溶液對豆芽中的脂肪蛋白質(zhì)等雜質(zhì)的去除效果較差，在后續(xù)檢測過程中可能會損壞色譜柱，污染檢測器，故排除此提取溶劑。其他3種提取溶劑經(jīng)儀器測定，以化合物對應(yīng)峰面積為指標(biāo)，考察提取結(jié)果，結(jié)果如圖1所示。結(jié)果顯示，1%甲酸乙腈對豆芽中的15種喹諾酮類藥物的提取效果較優(yōu)，故選定1%甲酸乙腈溶液作為提取溶劑。

圖1 不同提取試劑對豆芽中15種喹諾酮類藥物的提取結(jié)果對比

2.2 凈化條件的優(yōu)化

N-丙基乙二胺（primary secondary amine sorbent，PSA）可去除樣品基質(zhì)中的極性干擾物質(zhì)；C18作為一種反向硅膠鍵合吸附劑，可較好地吸附脂肪，除去樣品中脂類雜質(zhì)；無水硫酸鎂（MgSO4）可快速吸附樣本中多余的水分，降低目標(biāo)物在水相中的溶解[19]，故試驗考察PSA、C18、無水硫酸鎂3種凈化材料對喹諾酮類藥物回收率的影響，樣品在使用相同提取試劑以及相同加標(biāo)量10 μg/kg條件下分別考察凈化材料單獨使用與組合使用對待測物回收率的影響，效果對比如圖2所示。結(jié)果表明100 mg MgSO4+100 mg C18對目標(biāo)化合物的凈化效果最好，所以選擇100 mg MgSO4+100 mg C18作為凈化劑。

圖2 不同凈化條件下的凈化效果比較

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

由于喹諾酮類化合物的分子結(jié)構(gòu)中含有羰基結(jié)構(gòu)，在質(zhì)譜ESI源的正離子模式下易于形成[M+H]+的準(zhǔn)分子離子，正離子模式下的響應(yīng)值遠(yuǎn)高于負(fù)離子模式[24]。所以試驗采用ESI+模式對15種目標(biāo)化合物進行質(zhì)譜全掃描分析，得到相應(yīng)的母離子后，通過測試不同的Fragmentor電壓值下母離子的響應(yīng)強度選出最佳電壓值，而后進行子離子掃描，選出2個響應(yīng)值最高的特征離子作為定量離子和定性離子。在MRM模式下優(yōu)化碰撞能量（collision energy，CE），確定每種化合物的最佳質(zhì)譜條件，15種喹諾酮類藥物質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化結(jié)果見表2，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)提取的離子色譜圖見圖3。

圖3 15種喹諾酮類藥物的離子色譜圖

2.4 線性關(guān)系及定量限

將空白樣品按上述前處理方法制得空白基質(zhì)溶液，用空白基質(zhì)溶液將混合標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋成1，2，5，10，20和50 ng/mL的系列溶液。以目標(biāo)化合物定量離子的峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)得到線性回歸方程。15種喹諾酮類化合物在豆芽基質(zhì)中的線性相關(guān)系數(shù)均大于0.997，表明在1~50 ng/mL范圍內(nèi)各化合物均呈良好的線性關(guān)系。通過豆芽的陰性樣品加標(biāo)測定，15種喹諾酮類藥物在3 μg/kg的添加水平下經(jīng)過前處理所得試液的信噪比（rSN）均大于10，表明該方法15種喹諾酮類化合物的定量限均可達(dá)3 μg/kg。線性方程、相關(guān)系數(shù)及定量限見表3。

表3 豆芽中15種喹諾酮類藥物的線性關(guān)系及定量限

2.5 方法回收率和精密度

分別制備相當(dāng)于含15種喹諾酮類藥物10，20和80 μg/kg的低、中、高3個濃度水平豆芽樣品，每個水平分別做6份平行試驗，計算回收率和精密度。15種喹諾酮類藥物在豆芽中不同濃度的回收率及精密度見表4。結(jié)果顯示，15種喹諾酮在10 μg/kg的添加水平下，回收率為75.1%~102.3%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（SRSD）為2.4%~9.3%（n=6），在20 μg/kg的添加水平下，回收率為77.2%~97.4%，SRSD為1.3%~9.0%（n=6），在80 μg/kg的添加水平下，回收率為74.3%~96.6%，SRSD為2.2%~8.6%（n=6）。在不同的添加水平下，樣品基質(zhì)中的重現(xiàn)性與平行性均較好，可滿足多種樣品基質(zhì)大批量檢測的需求。表明該方法準(zhǔn)確性、精密度和重復(fù)性良好。

表4 豆芽中15種喹諾酮類藥物的回收率及精密度（n=6）

2.6 實際樣品檢測

從周邊不同市場隨機購買28批豆芽進行檢測，共有8個批次檢出環(huán)丙沙星，含量介于20.9~685 μg/kg，檢出率為28.6%。整個試驗過程操作快速便捷，檢驗效率高，表明該方法適合用于大批量豆芽樣品的檢測。

3 結(jié)論

試驗改進豆芽中15種喹諾酮類化合物測定的高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法，從經(jīng)濟成本上考慮，QuEChERS前處理方法相較傳統(tǒng)的HLB柱固相萃取柱凈化法，節(jié)約了試驗成本。從效率上考慮，QuEChERS前處理操作更加簡單快速、凈化效果良好、試驗結(jié)果準(zhǔn)確可靠，能一次性測定豆芽中15種喹諾酮類化合物，滿足監(jiān)管需要，可為豆芽中喹諾酮藥物殘留的風(fēng)險監(jiān)測提供技術(shù)支持。