QuEChERS結合GC-MS/MS測定腌臘肉制品中N-二甲基亞硝胺

沈昌瑩，蘇駿敏，莫淑梅，朱潔靈

東莞市食品藥品檢驗所（東莞 523808）

NDMA是由其前體物質亞硝酸鹽和胺類在一定條件下發生亞硝基化反應生成的一類亞硝胺類化合物[1]，具有強致癌性和肝毒性，長期小劑量攝入和一次性大劑量攝入均可引發癌癥[2]。在2013年的復旦投毒案中，受害人因被投毒NDMA，導致急性肝壞死引起急性肝功能衰竭，繼發多器官功能衰竭死亡；2018年，加拿大女王大學的中國博士留學生投毒室友一案中，受害人因多次攝入NDMA最終導致肝臟嚴重受損。在食品尤其是腌臘肉制品中，常用作發色和抑菌作用的亞硝酸鹽與微生物分解蛋白質形成的胺類為NDMA的形成提供了條件。因此，GB 2762—2022《食品中安全國家標準 食品中污染物限量》[3]規定肉及肉制品中NDMA的限量為3.0 μg/kg。目前檢測食品中的NDMA主要采用GB 5009.26—2016《食品安全國家標準 食品中N-亞硝胺類化合物的測定》[4]，該方法利用水蒸氣蒸餾的方式提取試樣中的NDMA，經二氯甲烷萃取濃縮后，采用氣相色譜串聯質譜（GC-MS）中的選擇離子掃描（SIM）模式進行測定。采用國標方法測定時，稱樣量需要200 g，平行測定時最少需要400 g，試樣取樣量大；單個試樣需要用到70 g氯化鈉和250 mL的二氯甲烷，對試劑的消耗量大；實驗室多用凱氏定氮儀進行蒸餾提取，單次只能蒸餾一個試樣，后續對提取液進行萃取和減壓蒸餾濃縮，試驗過程耗費時間長；采用SIM模式進行測定時，由于NDMA經電離后產生特征碎片離子質量較小，樣品基質對目標峰影響較大，定性不夠準確。近年來許多關于氣相色譜質譜法測定肉制品中的NDMA的研究被報道，通過減少試樣的取樣量至10~25 g，經水、乙腈或二氯甲烷提取，結合QuEChERS或固相萃取柱凈化，采用SIM或MRM模式進行測定，外標或同位素內標法進行定量[5-8]。此研究建立了一種采用超純水提取、乙腈萃取、QuEChERS凈化的GC-MS/MS同位素內標法測定腌臘肉制品中的NDMA，可以減少測定肉制品中的NDMA所需要的試樣和試劑用量，提高提取和凈化的效率，測定時采用MRM模式減少雜質對NDMA的定性的干擾，在稱樣后加入NDMA的同位素內標N-二甲基亞硝胺-D6（NDMA-D6）減少實驗和進樣過程對定量的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試樣及來源

臘肉、臘腸、臘鴨（市售）。

1.1.2 試劑及來源

乙腈（色譜純，德國Merck集團）；試劑組合1：Agilent Bond Elut EMR-Lipid dSPE增強型脂質去除凈化管、Agilent Bond Elut EMR-Lipid Polish反萃管（美國安捷倫科技公司）；試劑組合2：N-二甲基亞硝胺專用凈化鹽包、QuEChERS凈化管（深圳逗點生物技術有限公司）；試驗用水（Milli-Q超純水）。

1.1.3 標準品及來源

NDMA（CAS號：62-75-9；質量濃度100.1 μg/mL，北京曼哈格生物科技有限公司）；NDMA-D6（CAS號：17829-05-9；質量濃度100.1 μg/mL，北京曼哈格生物科技有限公司）。

1.2 儀器與設備

1.2.1 輔助儀器設備及來源

HS 501數顯型震蕩搖床（德國IKA公司）；BC-1 000多管渦旋混勻儀（深圳逗點生物公司）；3 K 15低溫離心機（配備19776-H轉子，德國SIGMA公司）；移液器（規格：200 μL，1 000 μL，5 mL和10 mL；德國Eppendorf公司）。

1.2.2 計量儀器設備及來源

MS1 003 TS電子分析天平（瑞士METTLER TOLEDO公司）；TQ 8050氣相色譜質譜聯用儀（日本SHIMADZU公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 色譜條件

氣相條件：毛細管氣相色譜柱：HP-INNOWAX（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；載氣：高純度氦氣（純度≥99.999%）；柱流量：1 mL/min；進樣口溫度：220 ℃；進樣方式：不分流進樣；進樣體積：1 μL。升溫程序見表1。

表1 升溫程序

質譜條件：離子源，電子轟擊源（EI）；傳輸線溫度：230 ℃；離子源溫度：230 ℃；溶劑延遲時間：5 min；監測方式：MRM；NDMA和NDMA-D6的保留時間（RT）、定性離子、定量離子和碰撞電壓（CE）見表2。

表2 NDMA和NDMA-D6的RT、定性離子、定量離子和CE

1.3.2 樣品前處理

稱取10 g試樣于50 mL離心管中，加入200 ng內標溶液，加入20 mL超純水，振蕩提取30 min，按4 ℃，9 000 r/min離心5 min，取8 mL上清液，加入8 mL乙腈，加入4 g氯化鈉，振蕩15 min，按9 000 r/min離心2 min，取乙腈上清液至50 mL離心管，加入凈化鹽包，渦旋1 min，按9 000 r/min離心2 min，取4 mL上清液到凈化管，渦旋15 min，按9 000 r/min離心2 min過0.22有機濾膜后上機。并進行空白試驗。

1.3.3 標準溶液配制

準確移取1.00 mL NDMA母液至50.0 mL容量瓶中，乙腈定容至刻度，配制成質量濃度為2.00 μg/mL的目標物一級稀釋液（a液），于4 ℃避光保存；準確移取0.100 mL a液至10.00 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，配制成質量濃度為20.0 ng/mL的目標物二級稀釋液（b液，臨用現配）；準確移取0.200 mL NDMA-D6母液至20.00 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，配制成質量濃度為1.00 μg/mL的內標儲備液（c液），于4 ℃避光保存。分別準確移取0.200，0.250，0.500，1.00和2.50 mL b液以及0.050 0，0.100 mL a液于10.00 mL容量瓶中，分別加入0.100 mL c液，用乙腈定容至刻度，得到NDMA質量濃度分別為0.400，0.500，1.00，2.00，5.00，10.0和20.0 ng/mL以及NDMA-D6質量濃度均為10.0 ng/mL的標準系列工作液。

2 結果與分析

2.1 儀器條件優化

2.1.1 氣相條件的優化

采用與國標方法中性能相似的毛細管氣相色譜柱以及與國標方法相同的氣相色譜條件，對NDMA和NDMA-D6進行全掃，結果發現NDMA和NDMA-D6的保留時間在升溫程序從80 ℃升溫至90 ℃的過程中，因此升溫程序從40 ℃升至80 ℃后，以1 ℃/min升至90℃，NDMA和NDMA-D6出峰后即可以20 ℃/min升至240 ℃。優化后的運行時間為24 min，相較國標方法的33 min縮短了9 min，大大縮短儀器進樣分析時間。

2.1.2 質譜條件的優化

采用優化后的氣相色譜條件對NDMA和NDMA-D6分別進行全掃，獲得NDMA和NDMA-D6的保留時間和前體離子，CE以3 V為步長從3 V到45 V，共創建15個不同CE的產物離子掃描方法，對NDMA和NDMA-D6的混合溶液進樣分析，將得到的數據輸入軟件分析后得出NDMA和NDMA-D6各兩對離子對信息及其最佳CE，見圖1。

圖1 NDMA和NDMA-D6的產物離子信息

2.2 前處理的優化

2.2.1 提取試劑的選擇

在50 mL離心管中加入100 ng的NDMA和100 ng的NDMA-D6，采用1.1.2小節中兩種試劑組合按照各自使用方法提取和凈化（稀釋倍數均為10），取上清液過膜后上機，比較空白加標回收率，試劑組合1處理后的空白加標回收率約為80%，試劑組合2處理后的空白加標回收率約為100%，可知選用試劑組合2處理更合理。

2.2.2 提取方法的優化

稱取多份腌臘肉制品試樣各10 g試樣于50 mL離心管中，采用試劑組合2進行提取和凈化，進樣分析后發現部分試樣的NDMA定量離子左側有雜峰，如圖2（a）所示。雜峰保留時間與NDMA定量離子保留時間接近，會影響部分試樣中NDMA的準確定量，這是由于試樣直接經乙腈提取，凈化不充分導致進樣試液中仍帶有部分干擾成分。根據NDMA易溶于水的特點，采用超純水對試樣進行提取，低溫離心除去油脂，再用乙腈萃取水提取液中的NDMA，通過加入氯化鈉使乙腈與水分層，最后用試劑組合2對乙腈層進行凈化，進樣分析后，如圖2（b和c）所示，同一試樣中的NDMA定量離子的峰不受雜峰干擾。因此，確定提取流程為采用20 mL超純水提取10 g腌臘肉制品，低溫離心除脂后，再用8 mL乙腈萃取8 mL水提取液，乙腈提取液經試劑組合2凈化后進樣分析（稀釋倍數為20）。

圖2 MRM模式下不同前處理NDMA的色譜圖

2.3 方法學驗證

2.3.1 線性關系和SLOQ

經乙腈稀釋的0.400~20.0 ng/mL的NDMA標準系列工作液，以NDMA-D6為內標，采用優化后的儀器條件進樣分析，NDMA和NDMA-D6各離子對的色譜圖見圖3。以濃度比率為橫坐標，以NDMA定量離子峰面積與NDMA-D6定量離子峰面積比值為縱坐標，采用強制通過原點的方式繪制校準曲線，如圖4所示，NDMA的線性關系良好，線性回歸方程為Y=0.081 33X，相關系數（R）為0.999 983，判定系數（R2）為0.999 966，滿足GB/T 27404—2008《實驗室質量控制規范 食品理化檢測》[9]對校準曲線線性回歸方程相關系數的要求。為滿足對試樣定量與結果判定的需求，制備加標試樣，經優化后的條件前處理和進樣分析，劃定NDMA定量離子對的峰約10倍信噪比時所對應的含量為SLOQ，結果見圖5，劃定SLOQ為1.00 μg/kg，信噪比為12.32。結果表明，此研究相較國標方法，在減少稱樣量和試劑使用量以及簡化提取凈化流程后，依然能達到國標方法的SLOQ。

圖3 NDMA和NDMA-D6各離子的疊加色譜圖

圖4 NDMA的校準曲線圖譜

圖5 NDMA的SLOQ色譜圖

2.3.2 準確度和精密度

以SLOQ、3倍SLOQ（即肉及肉制品中NDMA限量）、20倍SLOQ進行三水平六平行加標試驗，每個水平稱取六份10 g的陰性試樣，三個水平分別加入10.0，30.0和200 ng的NDMA標準溶液以及200 ng的NDMA-D6標準溶液，制備1.00，3.00和20.0 μg/kg的加標樣液，記錄平均回收率和SRSD。如表3所示，結果滿足GB/T 27404—2008[9]中對回收率和精密度的要求。

表3 NDMA的平均回收率及SRSD（n=6）

2.4 實際樣品的測定

采用此研究所建立的方法測定市售的4批臘腸、3批臘肉、3批臘鴨共10批腌臘肉制品試樣，檢測定結果發現，10批腌臘肉制品均無檢出，符合GB 2762—2022[3]中肉及肉制品中NDMA的規定。

3 結論

此研究基于國標方法，優化了儀器條件和前處理條件，建立了一種QuEChERS結合GC-MS/MS的同位素內標法測定腌臘肉制品中NDMA的方法。該方法減少取樣量以及減少試劑使用量，簡化提取和凈化過程，縮短了進樣分析時間，降低檢測過程對實驗人員的要求；以MRM模式代替SIM模式，以內標法代替外標法定量，提高了定性和定量分析的準確性，為測定腌臘肉制品中的NDMA提供一種新的可靠方法。