離子色譜法測定牛奶及奶制品中硝酸鹽和亞硝酸鹽

鄒沫君

樂山市食品藥品檢驗檢測中心（樂山 614000）

硝酸鹽和亞硝酸鹽在食品加工工業中常被用作發色劑、增香劑和防腐劑[1]。如果保存和處理不當，在硝基還原酶的作用下，食品中的硝酸鹽可能轉化為亞硝酸鹽[2-3]。過量攝入亞硝酸鹽可導致食用者中毒，亞硝酸鹽被人體血液吸收后，可將血紅素中Fe2+氧化為Fe3+，造成正常的血紅蛋白被氧化為高鐵血紅蛋白，從而失去攜帶氧氣的功能，出現組織缺氧現象。與此同時，亞硝酸鹽與蛋白質代謝的中間產物仲胺反應，生成強致癌作用的亞硝胺，對人的身體健康構成巨大危害[4-5]。因此，食品中硝酸鹽和亞硝酸鹽的含量都必須得到有效監控，以保障人類生活安全[6]。

在奶牛的飼養過程中，如果環境水源、喂養飼料的添加劑以及奶牛生長環境等硝酸鹽、亞硝酸鹽含量過高，都會發生牛奶中的硝酸鹽及亞硝酸鹽的超標[7-8]。隨著人們生活質量的提高，牛奶及奶制品在人們日常飲食中所占比重越來越大，質量安全也越來越受到重視[9]。根據GB 2762—2022[10]《食品安全國家標準 食品中污染物限量》規定，生乳中亞硝酸鹽（以NaNO2計）限量為0.4 mg/kg，乳粉、調制乳粉及嬰幼兒配方食品中亞硝酸鹽（以NaNO2計）限量為2.0 mg/kg，嬰幼兒配方食品中硝酸鹽（以NaNO3計）限量為100 mg/kg。因此，加強預防和檢測牛奶及奶制品的硝酸鹽、亞硝酸鹽污染是非常必要的。

硝酸鹽和亞硝酸鹽檢測常用的方法有分光光度法[11-12]、電化學法[13-14]、分子熒光法[15-16]、氣相色譜法[17-18]、離子色譜法[19-20]等。分光光度法操作繁瑣，需鹽酸萘乙二胺柱前衍生，操作繁瑣，干擾大，會引入重金屬污染物鎘，對檢驗員及環境危害很大。電化學法重現性不好，定量結果不精確。分子熒光法易受試樣中干擾物的影響導致相對標準誤差增大。氣相色譜法需配備電子捕獲檢測器，衍生試劑昂貴，操作過程復雜，費時費力。離子色譜法一直是牛奶及奶制品中硝酸鹽及亞硝酸鹽檢測的研究熱點，其前處理相對簡單，分析快速，無有害物質生成，分離度高，重現性好，可同時進行多組分測試。此試驗探索建立離子色譜法同時測定牛奶及奶制品中硝酸鹽、亞硝酸鹽的快速檢測方法，試樣用乙腈沉淀蛋白，經固相萃取柱凈化，用陰離子交換柱IonPac AS 19分離，電導檢測器檢測，測定牛奶及奶制品中硝酸鹽、亞硝酸鹽的含量。旨在為更精確更快速地檢測牛奶及奶制品中硝酸鹽、亞硝酸鹽提供參考依據，達到有效監控牛奶及奶制品中硝酸鹽、亞硝酸鹽含量的目的。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗所用牛奶和奶制品（16個批次，每個批次均來自不同的生產廠家，市售）；硝酸根NO3-標準品[1 000 μg/mL，唯一標識204036-3，國家有色金屬及電子材料分析測試中心、國標（北京）檢驗認證有限公司]；亞硝酸根NO2-標準品[1 000 μg/mL，唯一標識223028-1，國家有色金屬及電子材料分析測試中心、國標（北京）檢驗認證有限公司]；乙腈、冰乙酸（色譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司）；鹽酸（原子熒光純，成都市科隆化工試劑廠）；實驗室用水（超純水）（電阻率為18.25 MΩ·cm）。

1.2 儀器與設備

Thermo Scientific TM ICS-1 100離子色譜系統（含電導檢測器、陰離子抑制器、自動淋洗液發生器、自動進樣器、色譜數據系統，美國Thermo SCIENTIFIC公司）；XSE 205 DU電子天平[梅特勒-托利多國際貿易（上海）有限公司]；TGL-16臺式高速冷凍離心機（四川蜀科儀器有限公司）；Dionex OnGuard II RP柱（1.0 mL）、DionexOnGuard II Ag柱（1.0 mL）、DionexOnGuard II Na柱（1.0 mL），Thermo SCIENTIFIC公司；UPT-II-10 T優普系列超純水器（四川優普超純科技有限公司）；0.22 μm水系進口聚醚砜PES針式過濾器（美國PALL公司）；φ15 cm定量濾紙（杭州特種紙業有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：IonPacTMAS-194 mm×250 mm（帶IonPacTMAG-19型保護柱4 mm×50 mm）；淋洗液：淋洗液自動發生器，濃度為6~70 mmol；抑制器：連續自動再生膜陰離子抑制器；檢測器：電導檢測器，檢測池溫度：35 ℃；淋洗液流速：1.0 mL/min；進樣體積：50 μL。

1.3.2 標準溶液的配制

準確移取一定量的硝酸根NO3-標準品和亞硝酸根NO2-標準品，用水逐級稀釋成硝酸根NO3-濃度分別為0.00，0.20，0.40，0.60，0.80，1.00，1.50和2.00 mg/L，亞硝酸根NO2-濃度分別為0.00，0.02，0.04，0.06，0.08，0.10，0.15和0.20 mg/L的混合標準工作液。在1.3.1小節色譜條件下從低到高濃度依次進樣，得到上述各濃度標準溶液的色譜圖。以硝酸根NO3-和亞硝酸根NO2-的濃度（mg/L）為橫坐標，以峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，并計算線性回歸方程。

1.3.3 試樣制備

1.3.3.1 提取

牛奶：準確稱取2.5 g（精確至0.01 g）試樣于25 mL比色皿中，加5~10 mL純水，加入10 mL乙腈，加水稀釋至刻度，搖勻超聲30 min，置75 ℃水浴放置5 min。采用定量濾紙初步過濾，取濾液于10 000 r/min速度離心15 min，取上清液備用。

奶粉、奶制品：準確稱取2.5 g（精確至0.01 g）試樣，置于50 mL容量瓶中，加10 mL水，待充分溶解后，加入20 mL乙腈，加水稀釋至刻度，搖勻，超聲30 min，置75 ℃水浴中放置5 min，用水稀釋至刻度。溶液經定量濾紙過濾后，于10 000 r/min離心15 min，取上清液備用。

1.3.3.2 凈化

取15 mL濾液，依次通過0.22 μm水性濾膜針頭濾器、DionexOnGuard II Ag柱、DionexOnGuard II Na柱、DionexOnGuard II RP柱，棄去前面3 mL，收集后面洗脫液待測。固相萃取柱使用前需進行活化：Dionex-OnGuard II Ag柱和DionexOnGuard II Na柱用10 mL水通過，靜置活化30 min，OnGuard II RP柱使用前依次用10 mL甲醇、10 mL水通過，靜置活化30 min。

空白試驗：除不加試樣外，按1.3.3小節方法操作，即得。

1.3.4 結果計算

式中：X為試樣中硝酸根NO3-或亞硝酸根NO2-的含量，mg/kg；C為測定用試樣溶液中的硝酸根NO3-或亞硝酸根NO2-的濃度，mg/L；Co為試劑空白液中硝酸根NO3-或亞硝酸根NO2-的濃度，mg/L；V為試樣溶液體積，mL；f為試樣溶液稀釋倍數；m為試樣取樣量，g；1 000為換算系數。

2 結果與分析

2.1 提取條件的選擇

2.1.1 沉淀劑的選擇

牛奶及奶制品中含有豐富的蛋白質、脂肪、碳水化合物、維生素和礦物質等營養成分，為了能夠充分提取試樣中的硝酸鹽和亞硝酸鹽，此試驗比較了不同濃度的沉淀劑乙腈、冰乙酸、鹽酸沉淀蛋白的效果，結果見圖1。由圖1可知：在乙腈與水體積比4∶6時，是理想的牛奶及奶制品中蛋白沉淀劑。

圖1 乙腈與水的體積比（A）、冰乙酸濃度（B）及鹽酸濃度（C）對硝酸鹽和亞硝酸鹽的回收率的影響

2.1.2 提取溫度的選擇

此試驗考察了提取溫度為25，35，45，55，65，75，85和95 ℃時硝酸鹽和亞硝酸鹽的提取效果，結果見圖2。由圖2可知：不同提取溫度對硝酸鹽和亞硝酸鹽的提取率影響比較明顯，當提取溫度在75 ℃時，硝酸鹽和亞硝酸鹽的提取率趨于穩定，提取完全，故本試驗選擇提取溫度為75 ℃。

圖2 提取溫度對硝酸鹽和亞硝酸鹽的回收率的影響

2.1.3 提取時間的選擇

試驗比較了超聲時間為5，10，20，30，40，50和60 min時硝酸鹽和亞硝酸鹽的提取效果，結果見圖3。由圖3可知，隨著超聲時間的增加，硝酸鹽和亞硝酸鹽的提取率逐漸增大，到30 min后基本趨于穩定，為了加快前處理速度，節約時間，故此試驗選擇超聲30 min為最佳提取時間。

圖3 提取時間對硝酸鹽和亞硝酸鹽的回收率的影響

2.2 方法學驗證

2.2.1 專屬性考察

分別取混合標準工作溶液，陰性試樣溶液及陰性加標試樣溶液在1.3.1小節色譜條件下進樣50 μL，記錄色譜圖，考察試驗方法的專屬性，結果如圖4所示。結果表明，硝酸根NO3-和亞硝酸根NO2-保留時間分別為10.39和7.56 min，峰型對稱，加標試樣出峰良好，該方法專屬性好，選擇性高，適合牛奶及奶制品中硝酸根NO3-和亞硝酸根NO2-的測定。

圖4 混合標準工作溶液（A），陰性試樣溶液（B）及陰性加標試樣溶液（C）色譜圖

2.2.2 線性關系，方法檢出限和定量限考察

取硝酸根NO3-和亞硝酸根NO2-混合標準工作溶液，按1.3.1小節色譜條件從低到高濃度依次進樣，分別以硝酸根NO3-和亞硝酸根NO2-的峰面積對質量濃度計算線性回歸方程，確定相關系數。比較硝酸根NO3-和亞硝酸根NO2-色譜信號峰與基線信號，確定儀器最低檢出限（rSN=3），按試樣制備過程，分別得出方法檢出限與定量限，結果見表1。由表1可知：硝酸根NO3-在0.0~2.0 mg/L范圍內線性關系良好（r=0.999 9），且該方法檢出限為0.075 mg/kg，定量限為0.25 mg/kg；亞硝酸根NO2-在0.0~0.20 mg/L范圍內線性關系良好（r=0.999 9），且該方法檢出限為0.05 mg/kg，定量限為0.17 mg/kg。試驗結果均能完全滿足分析檢測要求。

表1 回歸方程，相關系數，最低檢出限，定量限

2.2.3 方法精密度考察

取0.20 mg/L硝酸根NO3-和亞硝酸根NO2-標準溶液，在上述條件下分別重復進樣6次，計算其結果相對標準偏差（SRSD），結果見表2。由表2可知，硝酸根NO3-和亞硝酸根NO2-的峰面積SRSD分別為0.46%和0.43%，說明該方法精密度良好。

表2 方法精密度試驗結果（n=6）

2.2.4 穩定性考察

取制備好的牛奶試樣供試品溶液，按1.3.1小節色譜條件每間隔4 h進樣1次，測定硝酸根NO3-和亞硝酸根NO2-的質量濃度，結果見表3。由表3可知，硝酸根NO3-和亞硝酸根NO2-穩定性試驗SRSD值分別為0.64%和0.62%，說明供試品溶液在24 h內穩定。

表3 穩定性試驗結果（n=7）

2.2.5 回收率考察

為考察方法的準確性，分別向牛奶，奶制品試樣中添加0.25，0.5和2.5 mg/kg硝酸根NO3-標準溶液以及0.12，0.24和1.20 mg/kg亞硝酸根NO2-標準溶液，各梯度同時平行測定3次，扣除樣品空白后，硝酸根NO3-和亞硝酸根NO2-平均回收率及其SRSD如表4所示。硝酸根NO3-平均回收率在92.98%~104.53%范圍內，SRSD為0.91%~1.23%；亞硝酸根NO2-平均回收率在92.85%~105.50%范圍內，SRSD為0.86%~1.21%。結果表明，該檢測方法準確性良好，符合分析檢測要求。

表4 加標回收率試驗結果（n=3）

2.2.6 實際試樣分析

利用此試驗所建立的方法，對市面上采購的16個批次牛奶和奶制品中硝酸根NO3-和亞硝酸根NO2-進行了測定，結果見表5。由表5可知，該方法具有良好的適用性，色譜無干擾，不同廠家牛奶和奶制品中硝酸根NO3-和亞硝酸根NO2-含量存在一定的差異，均未超過食品中污染物限量值。

表5 實際試樣檢測結果

3 結論

試驗建立了離子色譜法測定牛奶及奶制品中硝酸鹽和亞硝酸鹽含量的方法。試樣以乙腈沉淀蛋白，超聲振蕩提取，固相萃取柱凈化除雜，采用IonPac AS 19陰離子交換色譜柱（250 mm×4 mm）分離，6~70 mmol/L KOH溶液梯度淋洗，抑制性電導檢測。該方法操作便捷，檢測時間短，靈敏度高，回收理想，精密度高，線性范圍廣，適合牛奶及奶制品中硝酸鹽和亞硝酸鹽的測定，可為牛奶及奶制品質量標準的提升和食品安全監管提供一定的數據支撐，具有良好的推廣應用價值。