液質聯用法測定部分原料中的阿維菌素

王亞會，李祥波

上海太太樂食品有限公司（上海 200000）

阿維菌素（avermectin）是一類具有殺蟲、殺螨、殺線蟲活性的十六元大環內酯化合物，其藥物已成為高毒有機磷農藥的替代品，被廣泛應用于作物種植與動物養殖中，其作用計量小，但脂溶性較高，降解比較緩慢，導致此藥物在動物體內殘留時間長，可能給食品安全帶來隱患，世界衛生組織將其列為高毒化合物[1-5]。

許多國際組織和國家（地區）對阿維菌素殘留量進行限制，歐盟規定各種蔬菜、水果及谷物中最大殘留量（MRL）為20 μg/kg，日本規定梨中的MRL為20 μg/kg[6]。我國對不同類別的食品規定的阿維菌素的MRL也不同，如精制芝麻、大蒜、洋蔥、姜、胡椒的MRL為50 μg/kg，小蔥的MRL為100 μg/kg，干辣椒的MRL為200 μg/kg[7]。受利益的驅使，仍有養殖戶違法超標使用阿維菌素。對植物過量噴灑阿維菌素驅蟲一旦在組織中蓄積人類食用后也會產生危害[5]。針對精制芝麻、大蒜、胡椒、小蔥、干辣椒等生產原料，為確保供應原料的食用安全，更為了保障消費者的切身利益，研究阿維菌素藥物殘留含量的檢測方法具有重要的現實意義。

試驗對農業部1025號公告-5-2008動物性食品中阿維菌素類藥物殘留檢測中的液相色譜-串聯質譜法進行優化，建立用液相色譜-串聯質譜法測定部分蔬菜及香辛料中的檢測方法，為產品質量安全的有效監管提供技術支撐。

圖1 阿維菌素的化學結構式

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

乙腈、甲醇、丙酮、無水硫酸鈉、甲酸、乙酸銨、正己烷（均為色譜純，上海安譜實驗科技股份有限公司）；阿維菌素標準品（純度≥98%，上海安譜實驗科技股份有限公司）；試驗用水為超純水。

精制芝麻（河南駐馬店）、大蒜（山東冠縣）、胡椒（泰州）、小蔥（云南玉溪）、干辣椒（河北雞澤縣）。

液相三重四極桿串聯質譜聯用儀（1200 G1312B/G6460A）；電子天平（ML303，梅特勒）；電子天平（XS105DU，梅特勒）；渦旋混合器（VORTEX GENIUS3，德國IKA公司）；旋轉蒸發儀（R-210/V-700/V850，BUCHI實驗儀器公司）；離心機（TG16-WS，長沙湘儀離心機儀器有限公司）；0.22 μm濾膜、Zorbax SB C18（50 mm×2.1 mm×1.8 μm）、C8固相萃取柱（500 mg、6 mL）、C18固相萃取柱（60 mg、3 mL），PSA固相萃取柱（60 mg、3 mL）（均為上海安譜科學儀器公司）。

1.2 標準品配制

1.2.1 阿維菌素準儲備溶液

準確稱取一定量阿維菌素準物質，用甲醇配成1.00 mg/mL的標準貯備溶液。于-18 ℃避光保存，保存期為1年。

1.2.2 標準儲備溶液

吸取阿維菌素準儲備溶液，用甲醇配成10 μg/mL。于-18 ℃避光保存，保存期3個月，使用前回溫到室溫。

1.2.3 標準工作溶液

根據需要，臨用前吸取一定量的混合標準儲備溶液，用甲醇-水（1︰1，V/V）稀釋配制成濃度梯度依次為5，10，25，50，100和200 μg/L的混合標準工作液。

1.3 試驗條件

1.3.1 色譜條件

色譜柱為Zorbax SB C18柱（50 mm×2.1 mm×1.8 μm）；流動相為乙腈、水（0.1%甲酸，2 mmol/L乙酸銨）；柱溫35 ℃；進樣量5 μL。

表1 液相色譜梯度洗脫條件

1.3.2 質譜條件

離子源為電噴霧離子源（ESI）；掃描方式為正離子掃描；檢測方式為多反應監測（MRM）；霧化氣（NEB）、氣簾氣（CUR）、輔助加熱氣（AUX）、碰撞氣（CAD）均為高純氮氣；使用前應調節各氣體流量以使質譜靈敏度達到檢測要求；噴霧電壓、去集簇電壓、碰撞能等電壓值應優化至最優靈敏度；Q1，Q3均為單位分辨率（UNIT）；定性離子對、定量離子對、碰撞氣電壓、去簇電壓，見表2。

表2 阿維菌素質譜參數

1.4 樣品前處理

1.4.1 樣品提取

從全部的樣品中取出約0.5 kg具有代表性樣品，充分攪碎，混勻，均分成2份，分別裝入潔凈的容器內。密封作為試樣，標明標記。在抽樣和制樣的操作過程中，應防止樣品受到污染或發生殘留物含量的變化。將試樣于-18 ℃冷凍保存。

準確稱取2 g樣品，精確至0.01 g，置于50 mL離心管中，加入15 mL乙腈，振蕩提取2 min，按4 000 r/min離心5 min，將上清液轉移到另一50 mL離心管中，殘渣用15 mL乙腈重復提取1次，按4 000 r/min離心5 min，合并2次提取液轉移至250 mL梨形瓶中，40 ℃水浴溫度下旋蒸至干。加3 mL乙腈︰水（1︰2，V/V）溶液，蝸旋震動1 min溶解殘渣，轉移至15mL離心管中，加3 mL乙腈︰水（1︰2，V/V）溶液至梨型瓶中，蝸旋震動1 min溶解殘渣，轉移至15 mL離心管中，合并2次溶解液，待凈化。

1.4.2 樣品凈化

依次用3 mL乙腈、3 mL乙腈︰水（4︰6，V/V）活化C8固相萃取小柱，將提取液過柱，棄去濾液，依次用3 mL乙腈︰水（4︰6，V/V），3 mL正己烷淋洗小柱，過完后減壓抽干，用6 mL乙腈洗脫。將洗脫液40 ℃氮氣吹干后，用1 mL乙腈+水溶液（1+1，V/V）溶解，過0.22 μm膜后供液質儀器分析

1.5 結果結算

式中：X為樣品中待測組分殘留量，μg/kg；X1為樣品中待測組分含量，μg/L；W為樣品實際稱樣量，g；V為樣品最終定容體積，mL。

1.6 數據分析

所有數據以平均值表示，用Excel繪制各物質含量變化圖。

2 結果與討論

2.1 質譜條件優化

文獻中對于阿維菌素檢測離子對的報道較多，但是質譜儀的結構及設計不同，相關的電壓也不相同。將質量濃度1 mg/mL的阿維菌素標準儲備液稀釋至0.1 μg/mL，采用蠕動泵直接進樣方式，分別在正離子（ESI+）、負離子（ESI-）模式下進行Q1母離子全掃描。結果表明，阿維菌素在ESI+模式下具有較高的響應值。分別考察噴霧電壓、霧化溫度、氣簾氣、霧化氣、輔助氣對離子響應強度的影響，同時對各分子離子進行子離子掃描，選取合適的離子對，在MRM模式下優化簇電壓和碰撞電壓。最終選定最優參數見表2中質譜條件，質譜圖見圖2。

圖2 阿維菌素質譜圖（0.1 μg/mL）

圖3 阿維菌素標準品色譜圖（0.1 μg/mL）

2.2 提取溶劑的選擇

阿維菌素為脂溶性化合物，難易溶于水，易溶于甲醇、乙腈、乙酸乙酯、丙酮、乙醇。比較甲醇、乙腈和丙酮作為樣品提取劑的提取效果，試驗結果顯示，用丙酮提取時因干辣椒、胡椒、小蔥含有色素，提取液的顏色深。甲醇對于含水量高的樣品，加入無水硫酸鈉后分離效果較差，綜上選擇乙腈作為提取溶劑。

2.3 凈化方法優化

阿維菌素為弱極性物質，測定樣品時，乙腈提取液中含有的極性色素、脂肪是主要干擾物質，固相微萃取技術（SPE）可有效去除色素。選擇常用的C18、C8、PSA固相萃取柱進行比較。C18固相萃取小柱基于鍵合的反相（二甲基十八碳硅烷）、不規則硅膠（硅膠基）顆粒。這種非極性、未封端的吸附劑提供與表面硅醇基相關聯的額外極性相互作用，因此C18具有良好的除脂能力。C8在吸附劑上與C18鍵合相類似，主要依靠非極性碳鍵相互作用。但由于C8烷基鏈較C18烷基鏈短，所以對非極性化合物保留弱于C18，有助于對非極性或弱極性吸附過強的樣品的洗脫。PSA有2個氨基（伯胺和仲胺），且2個氨基的pKa值更高（分別是10.1和10.9），對極乙腈提取液中的脂肪酸、性色素可有效去除。

結果表明，阿維菌素的回收率C18固相萃取小柱優于PSA，C8優于C18。

圖4 不同固相萃取小柱阿維菌素藥的回收率（n=6）

2.4 色譜條件優化

阿維菌素為弱極性物質，易在反向色譜柱中保留，故選則Zorbax SB C18（50 mm×2.1 mm×1.8 μm），試驗采用常用的乙腈-水溶液作為色譜的流動相，但結果表明，阿維菌素化合物在C18色譜柱上峰形較差，拖尾嚴重，基線噪聲較大；在水相中加入0.1%（V/V）的甲酸后，阿維菌素在色譜柱上的基線噪聲明顯降低，提高了檢測靈敏度，水相中加入2 mmol/L的乙酸銨時，阿維菌素的色譜峰型得到更好的改善，推測甲酸的加入能在一定程度上提高其在C18柱上的保留行為，因此選擇水（0.1%甲酸，2 mmol/L乙酸銨）-乙腈為流動相。

2.5 方法的線性范圍、相關系數、檢出限、定量限

采用外標法定量，以分析物的峰面積（y）和對應的質量濃度（x，μg/L）進行線性回歸計算，得到線性方程和相關系數。線性范圍為5~200 μg/L，阿維菌素的相關系數r大于0.995，通過向陰性樣品中添加標準品考察方法的檢出限、定量限，信噪比≥3為檢出限，信噪比≥10為定量限；每個標準品的添加量為0.2，0.5和1 μg/kg 3個水平，測得阿維菌素的檢出限為0.2 μg/kg，定量限為0.5 μg/kg。檢出限、定量限、線性相關系數、線性方程、回收率見表3。

表3 阿維菌素的線性范圍、回歸方程、方法檢出限和定量限

2.6 方法的回收率與精密度

阿維菌素在各檢測樣品中規定最高殘留限量（MRL），參考GB/T 27404—2008中的相關規定，對于已制定MRL，回收率和精密度都應在方法測定底線、MRL、選一合適點進行三水平測試，即選擇精制芝麻、大蒜、胡椒在0.2，0.5和50 μg/kg加標水平，小蔥在0.2，0.5和100 μg/kg的加標水平，干辣椒的在0.2，0.5和200 μg/kg的加標水平進行加標回收率和精密度試驗，重復測定至少6次。每個添加水平平行測定6次，結果見表4。精制芝麻在0.2，0.5和50 μg/kg加標水平下加標回收率范圍分別為76.72%~96.11%，85.47%~100.02%和91.45%~110.25%，相對標準偏差（SRSD）分別為6.93%，6.28%和6.92%。大蒜在0.2，0.5和50 μg/kg加標水平下加標回收率范圍分別為79.13%~91.32%，82.14%~94.15%和86.37%~106.28%，相對標準偏差（SRSD）分別為5.96%，5.53%和8.76%。胡椒在0.2，0.5和50 μg/kg加標水平下加標回收率范圍分別為80.28%~92.66%，86.24%~98.45%和90.15%~109.45%，相對標準偏差（SRSD）分別為6.16%，4.62%和9.20%。小蔥在0.2，0.5和100 μg/kg的加標水平加標回收率范圍分別為76.88%~99.56%，78.04%~87.49%和89.57%~107.24%，相對標準偏差（SRSD）分別為9.22%，4.94%和7.86%。干辣椒在0.2，0.5和200 μg/kg的加標水平加標回收率范圍分別為87.66%~107.68%，79.48%~89.47%和86.79%~105.46%，相對標準偏差（SRSD）分別為7.08%，5.20%和8.12%。結果均滿足GB/T 27404—2008規定的被測組分含量＜100 μg/kg，回收率在60%~120%，被測組分含量100~1 000 μg/kg，回收率在80%~110%，精密度（相對標準偏差）≤11%的要求。

表4 阿維菌素在部分陰性蔬菜、香辛料中的加標回收率和相對標準偏差（n=6）

3 結論

試驗建立部分蔬菜及香辛料中阿維菌素殘留量的高效效液相色譜-串聯質譜檢測方法。該方法具有操作簡單、節省時間、檢出限低于最大殘留限量規定等優點，可滿足相關食品檢測部門、食品企業等對食品中阿維菌素殘留的快速檢測，為嚴格質量管理監控提供必要的技術支持。