菊花葡萄酒中多酚類化合物的分析

宮英振，李敬川，張昂，裴俊青，劉俊

1.河北省林業(yè)和草原科學(xué)研究院 河北省林木良種技術(shù)創(chuàng)新中心（石家莊 050061）；2.秦皇島出入境檢驗檢疫局技術(shù)中心（秦皇島 066004）；3.棗強自然資源和規(guī)劃局（衡水 053100）

為了生產(chǎn)符合國人口味、具有中國特色的葡萄酒，研究人員展開了菊花特色系列葡萄酒的研發(fā)。曾有研究發(fā)現(xiàn)菊花（杭白菊）加入未對干紅葡萄酒的常規(guī)理化特性產(chǎn)生不利影響[1]。葡萄酒中含有大量的酚類物質(zhì)，其中大部分來源于葡萄果實，對葡萄酒的感官品質(zhì)有極大的影響，尤其對紅葡萄酒的色澤、苦味、收斂性、澄清度和穩(wěn)定性等起重要作用。此次試驗采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）對葡萄酒樣中的29種酚類化合物單體物質(zhì)進(jìn)行分析，以試圖研究菊花加入對干紅葡萄酒中酚類化合物的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菊花干紅葡萄酒樣品（自釀），釀酒葡萄為赤霞珠品種，葡萄酒發(fā)酵采用常規(guī)工藝釀造[1]。在葡萄破碎后添加干菊花，直至酒精發(fā)酵結(jié)束，隨同皮渣一起分離。

酚類物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品（色譜純，純度≥95%：德國Sigma-Aldrich公司）：沒食子酸（gallicacid，GA）、原兒茶酸（protocatechuate acid，PA）、(+)-兒茶素[(+)-catechin，CA]、(-)-表兒茶素[(-)-epicatechin，EC]、(-)-表沒食子兒茶素[(-)-epigallocatechin，EGC]、(-)-表沒食子兒茶素沒食子酸酯[(-)-epigallocatechin gallate，EGCG]、(-)-表兒茶素沒食子酸酯[(-)-epicatechin gallate，ECG]、咖啡酸（caffeic acid，CAA）、反式阿魏酸（trans-ferulic acid，F(xiàn)A）、對香豆酸（trans-p-coumaricacid，p-CA）、綠原酸（chlorogenic acid，CGA）、順式白藜蘆醇（cis-resveratrol，cis-Res）、反式白藜蘆醇（trans-resveratrol，trans-Res）、順式白藜蘆醇-3-O-β-D-葡萄糖苷（resveratrol-3-O-β-D-glycoside，Res-3-Gly）、山柰酚（kaemperol，Kae）、槲皮素（quercet in，Que）、槲皮素-3-O-葡萄糖苷（quercetin-3-glucoside，Que-3-Glu）、楊梅素（myricetin，Myr）、桑色素（morin hydrate，Mor）、漆黃素（fisetin，F(xiàn)is）、芹菜素（apigenin，Api）、木犀草素（luteolin，Lut）、牡荊素-2-O-鼠李糖苷（vitexin，Vit）、原花青素B1（procyandin B1，Pro B1）、原花青素B2（procyandin B2，Pro B2）、白皮杉醇（piceatannol，Pic）、香草酸（vanillic acid，VA）、葡萄素（viniferin，Vin）、紫鉚因（butein，But）。流動相：甲酸、乙腈（色譜純，美國Fisher公司）。其他試劑（分析純，上海國藥集團）。試驗用水為超純水。

Nexera LC-30A超高效液相色譜儀（日本島津公司）；QTRAP 4500三重四極桿質(zhì)譜儀（配有電噴霧離子源、Turbo V離子源和Analyst 1.5數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，美國AB Sciex公司）；ACQUITY UPLC? BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm，美國Waters公司）；Milli-Q去離子水機（美國Millipore公司）；3-30KS超高速離心機（美國熱電公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 葡萄酒樣品處理

葡萄酒發(fā)酵結(jié)束，取葡萄酒原酒酒樣。分析測定前經(jīng)0.45 μm膜過濾，然后取1 mL經(jīng)過濾酒樣，用10%甲醇溶液（含0.1%甲酸）稀釋100倍，按26 000 r/min離心5 min后取上清液進(jìn)行測定，根據(jù)測定結(jié)果重新取樣1 mL稀釋至適當(dāng)濃度重復(fù)離心，取上清液至進(jìn)樣瓶待測。

1.2.2 單體酚標(biāo)準(zhǔn)溶液和基質(zhì)液配制

單體酚標(biāo)準(zhǔn)品使用0.1%甲酸-甲醇溶液配制成100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于-20 ℃保存。使用時將儲備液使用10%甲醇（含有0.1%甲酸）溶液逐級稀釋成所需質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)工作液或混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.2.3 UPLC條件

柱溫為30 ℃，進(jìn)樣體積為10 μL，流速為0.25 mL/min，C18色譜柱分離，流動相A為0.1%甲酸水，流動相B為0.1%甲酸乙腈。洗脫程序：0~3.00 min，5%B；3.00~6.00 min，30% B；6.00~9.00 min，50% B；9.00~12.00 min，70% B；12.00~17.00 min，5% B。

1.2.4 MS條件

離子源：電噴霧離子源；掃描方式：負(fù)離子模式；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測；離子源溫度500 ℃；噴霧電壓：-4 500 V；氣簾氣壓力40 psi；碰撞氣：Medium；霧化氣壓力60 psi；輔助加熱氣壓力50 psi。

該方法線性回歸系數(shù)R2大于0.999，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.71%~2.87%之間，檢出限在0.2~3.5 μg/L之間，定量限在0.4~11.5 μg/L之間，加標(biāo)回收率在95%~100%之間[2]。

2 結(jié)果與分析

釀酒葡萄在破碎、取汁工藝后，加入1%干菊花（杭白菊）進(jìn)行浸漬、發(fā)酵，在發(fā)酵結(jié)束后，對菊花干紅、干白葡萄酒進(jìn)行29種多酚類化合物含量測定，結(jié)果如表1所示。有10種酚類物質(zhì)在干紅葡萄酒、干白葡萄酒均檢出，其中沒食子酸、兒茶素、表兒茶素三者為紅葡萄酒中含量最為主要的酚類物質(zhì)，均接近于10 mg/L，余者都在1 mg/L以上。在白葡萄酒中，咖啡酸、兒茶素、表兒茶素、沒食子酸含量較為豐富。綠原酸、芹菜素、木犀草素三種物質(zhì)為菊花中重要的藥效活性成分，在菊花葡萄酒中也以不同含量存在，其中綠原酸在檢出的酚類物質(zhì)中居于最高含量水平，無論是在干紅葡萄酒中還是在干白葡萄酒中均近30 mg/L，芹菜素、木犀草素含量均在10 mg/L以下。

表1 菊花葡萄酒中酚類物質(zhì)的含量 單位：mg/L

葡萄酒中酚類物質(zhì)主要來自于葡萄果皮和種子，因原料、釀造工藝的差別，菊花白葡萄酒中酚類物質(zhì)含量都遠(yuǎn)低于紅葡萄酒，而在白葡萄酒中除咖啡酸、兒茶素、表兒茶素外，其他酚類化合物含量都在1 mg/L以下。綠原酸、芹菜素、木犀草素等化合物為菊花中主要的藥效活性成分[3-4]，其含量無論在菊花干紅葡萄酒中還是菊花干白葡萄酒中都遠(yuǎn)高于對照，且綠原酸、芹菜素在紅葡萄酒與白葡萄酒之間差異不明顯，對照組含量均甚微。

3 結(jié)論

在菊花葡萄酒酚類物質(zhì)分析中，檢測出綠原酸、芹菜素、木犀草素3種中藥杭白菊中重要的藥效活性成分，且綠原酸在所檢測到的全部酚類物質(zhì)中含量最高。因此，菊花葡萄酒不僅使豐富了葡萄酒風(fēng)味，還提升了葡萄酒自身的營養(yǎng)保健特性。