城市污水處理廠抗生素抗性基因研究進展

張冰，趙琳，陳坦*

1.中央民族大學生命與環境科學學院

2.中央民族大學北京市食品環境與健康工程技術研究中心

抗生素是微生物的次級代謝產物，具有抑菌、滅菌的作用，自1928年發現青霉素以來，抗生素已廣泛應用于醫療行業與生產生活中[1]。但抗生素的濫用、亂用導致微生物的耐藥性持續提升，加劇環境中抗生素抗性基因（ARGs）和抗生素抗性細菌（ARBs）的廣泛傳播，嚴重威脅著人類健康與生態安全。由于ARGs 是ARBs 存在耐藥性的根本原因，即使ARBs 死亡，攜帶ARGs 的裸露DNA 仍會長期存在于環境中，因此ARGs 在環境中的持久性殘留、傳播和擴散危害極大[2]。

城市污水處理廠已被證明是抗生素和ARGs 的重要“源”與“匯”。據估計，大約30%～60%的處方抗生素[3]以及畜牧養殖和醫療廢水中的大量ARGs[4]在污水處理廠匯集，而活性污泥系統中較高的微生物濃度與多樣性以及亞抑制濃度抗生素的選擇壓將進一步促進ARGs 和ARBs 的生成與傳播。據報道，污水處理廠出水對下游水體ARGs 具有較高貢獻[5]，污水處理廠中ARGs 的種類與豐度顯著高于凍土與沉積物樣品[6]以及淡水[7]、土壤[8]等環境介質。在某些地區，市政污水中的ARGs 種類和豐度顯著高于醫院廢水[9]。現有的城市污水處理工藝主要針對COD、氨氮等常規污染物，對ARGs 的去除能力有限[10]，因此，如何有效去除ARGs 受到了全球學者的廣泛關注。

1 基于文獻計量的研究現狀簡述

為了解城市污水處理廠中ARGs 的相關研究進展與熱點，分別以“Antibiotic resistance gene*/ARG*”+“Wastewater treatment plant*/WWTP*”為主題在Web of Science（WoS）以及以“抗性基因”+“污水”為主題在中國知網（CNKI）檢索了2006年以來發表的相關論文。從2006年Pruden 等[11]提出ARGs 為新興污染物開始，污水處理廠與ARGs 有關研究呈逐年上升的趨勢，2013年進入快速上升階段，與抗生素的研究趨勢相近[12]。2006—2009年CNKI 僅報道了1 篇有關污水中ARGs 的論文，從2010年開始發文量才有所提升〔圖1（a）〕。雖然CNKI 發文量整體偏少，但利用VOSviewer 將WoS 核心合集檢索結果可視化后發現，以中國為發文國家的SCI 論文數量領先于其他國家和地區〔圖1（b）〕，表明我國在有關污水處理廠ARGs 的研究中具有重要的國際地位。進一步梳理和歸納后可以發現，現有研究主要關注以下4 個方面：1）ARGs 在污水處理過程以及后續環境介質中的歸趨；2）抗生素、重金屬等污染物對ARGs 的選擇壓力與相互作用；3）ARGs 的傳播擴散途徑；4）影響ARGs 豐度、多樣性和水平基因轉移的主要環境因素。本研究也主要圍繞這4 個方面展開綜述。

圖1 2006—2021年國內外有關污水處理廠ARGs 的發文統計Fig.1 Statistical charts of publications on ARGs in WWTPs at home and abroad from 2006 to 2021

2 城市污水處理廠中ARGs 的組成及豐度變化特征

2.1 主要ARGs 類型

8 大類ARGs 包括β-內酰胺類、大環內酯類、四環素類、磺胺類、氨基糖苷類、氟喹諾酮-喹諾酮-氟苯尼考-氯霉素-安非霉素（FCA）類、多藥類、萬古霉素類，在污水處理廠中均能檢出。其中磺胺類、四環素類、大環內酯類較為常見[13]，在美國、加拿大、中國等國的污水處理廠中被廣泛檢出[14]，表明這些ARGs可能存在于全球的污水處理系統中。在亞型方面，Wang 等[15]統計了全球有關污水處理廠ARGs 的文獻后發現，β-內酰胺類bla、磺胺類sul、四環素類tet和大環內酯類erm的報道較為廣泛，可能與其高豐度有關。城市污水管道中的污水和管道壁的生物膜上豐度最高的ARGs 是磺胺類抗性基因sul1 和sul2，占16S rRNA 基因拷貝數的約1/10[16]，其他豐度較高的亞型還包括四環素類抗性基因tetA 和tetG，萬古霉素類抗性基因vanA 和vanX，β-內酰胺類的bla、amp，大環內酯類的erm以及FCA 的emr、qnr[17]（表1）。有學者對中國11 個污水處理廠中的296 個ARGs 進行檢測后發現，7 種ARGs（包括氨基糖苷類抗性基因aadA、aadA1 和aadA2，β內酰胺類抗性基因blaVEM 和blaOXA-10，大環內酯類抗性基因ereA，多藥類抗性基因qacEdelta1）持久存在，它們分別占進水、污泥和出水中所檢測基因總拷貝數的54.1%、58.6% 和58.5%[18]。Su 等[19]采用宏基因組學分析了中國17 個城市中污水處理廠ARGs的分布，共檢測出381 種ARGs 亞型，其中氨基糖苷類、四環素類和β-內酰胺類共占54.1%，亞型中sul1 和tet40 最為常見。

表1 不同地區污水處理廠中不同種類ARGs 在進水、出水、污泥中的豐度變化Table 1 Variations of abundance of different kinds of ARGs in influent, effluent and sludge in various WWTPs

2.2 典型ARGs 的沿程變化

整體上，ARGs 經過一系列污水處理單元后，其在出水中的豐度（約103～1010拷貝/L）低于進水豐度（104～1012拷貝/L），去除率可達89.0%～99.8%[20]（表1）。但由于ARGs 的豐度和轉移機制受ARGs種類以及污水處理過程中多種因素的影響，不同ARGs 的豐度隨污水處理過程的變化特征各異，且不同處理單元中的高豐度ARGs 存在差異。具體地，磺胺類、四環素類ARGs 在進水中豐度較高，多在1010拷貝/L 左右，且二者在生物處理單元大量擴增，最后隨污泥沉降，在出水中豐度降低，去除率較高[24]；而氨基糖苷類、β-內酰胺類等ARGs 在前端處理階段相對豐度較低，但在出水中被大量檢出，數量級高達108拷貝/L[20]（表1）。部分磺胺類、β-內酰胺類、FCA 類ARGs 的去除沒有明顯規律，如sul1、qnrD 和blaTEM[28]在污水處理廠各個處理階段的豐度幾乎保持不變，與制藥廢水[29]、印染廢水[27]處理工藝中被大量去除的結果不同，這可能是由于此類基因具有復雜的代謝通路，或參與共選擇作用[29]（圖2）。

圖2 污水處理廠中ARGs 沿程變化模式Fig.2 Conceptual map of ARGs changes along the process in a WWTP

除了上述按照相應抗生素種類與結構分類外，ARGs 還可分為胞內型ARGs（iARGs）和胞外型ARGs（eARGs）。iARGs 多存在于污水處理廠等與人類活動相關的場所，而eARGs 多分布于自然環境中[30]。通常，污水處理廠進水中eARGs 的數量級（102拷貝/L）遠低于iARGs（108拷貝/L），甚至無法檢出，但污水廠其余構筑物以及出水eARGs 的絕對豐度和iARGs 相近（105拷貝/L）[23,31]，主要原因是污水處理過程中正常細胞的分泌外排和衰老細胞的裂解釋放使得eARGs 含量逐漸升高，而eARGs 又難以隨生化處理被去除，因此出水中eARGs 與iARGs 數量級相近，污水處理廠可能是ARGs 形態轉化的重要場所。

3 ARGs 在城市污水處理廠中的轉移機制

ARGs 的轉移方式主要包括垂直轉移（VGT）和水平轉移（HGT）2 種（圖3）。VGT 指ARGs 通過增殖從親代到子代含量逐漸增多的轉移過程[32]，當環境中無抗生素選擇時該轉移機制較為明顯；HGT 則指ARGs 在不同菌屬、環境間的轉移，能實現無性、遠緣的基因傳遞。活性污泥系統中較高的微生物濃度和多樣性能夠促進細菌間ARGs 的HGT[33-34]，同時，進水中次抑制濃度的抗生素為活性污泥系統中ARGs 水平傳播創造了有利條件[35]。因此，HGT 是活性污泥ARGs 主要的轉移方式[36]。例如，四環素類、β-內酰胺類、氟喹諾酮類等ARGs 可通過質粒進行HGT[37-38]，大環內酯類和四環素類還能通過整合結合元件（ICEs）等可移動遺傳元件（MGEs）進行HGT。不少研究表明intI1 與磺胺類、氨基糖苷類、β-內酰胺類、大環內酯類的部分亞型具有強相關性[24]，常作為HGT 的指示性基因。研究發現臨床intI1 基因序列和intI1 相似，臨床intI1 與ARGs 及人類病原體的豐度、去除效率的相關性更強[20]。后續可以深入研究臨床intI1，以進一步篩選和確定污水處理廠中的指示性ARGs。

圖3 ARGs 的垂直和水平轉移機理Fig.3 Mechanism of vertical and horizontal transfer of ARGs

iARGs 和eARGs 具有不同的HGT 途徑：iARGs可通過細胞間的接合和轉導進入新宿主細胞；而eARGs 則在原宿主細胞裂解后通過轉化直接被新宿主細胞吸收[8]〔圖3（b）〕。研究表明，自然環境中的各HGT 途徑中iARGs 接合頻率＞ eARGs 轉化頻率＞ iARGs 轉導頻率[39]。細菌受激后變成感受態是轉化的關鍵，而多數抗生素[40]、非抗生素類藥物[41]均能刺激細菌，提高細胞活性、細胞膜通透性，促進細菌轉化[42]。噬菌體介導的ARGs 轉導過程是一種關鍵的HGT 途徑，在一些污水[43]和污泥[44]噬菌體的基因組中也檢測出β-內酰胺類、磺胺類等ARGs。有學者檢測發現農村分散式污水處理設施中ARGs 的豐度與多種噬菌體相關[45]。隨著檢測技術和研究方法的快速發展，基因轉移劑（GTAs）逐漸受到關注。GTAs 是性能類似噬菌體的小型病毒樣顆粒，能夠隨機選擇宿主DNA 片段并將其轉移給受體細胞，其隨機性為ARGs 的HGT 帶來了較大風險[46]。

4 污水處理廠中影響ARGs 賦存及水平轉移的主要因素

除微生物群落外，污水進水水質、抗生素等污染物、溫度等環境因素以及停留時間等工藝條件同樣會對ARGs 的賦存及傳播機制產生影響（圖4）。

圖4 污水處理廠中ARGs 的主要影響因素Fig.4 Main influencing factors of ARGs in WWTPs

4.1 抗生素選擇

抗生素的使用對ARGs 存在著一定的選擇作用。例如有學者觀察到進水中的ARGs 在秋季和冬季具有較高濃度，與這2 個季節的高抗生素處方量呈正相關關系[20]；磺胺嘧啶、磺胺甲唑的存在可提高sul1、sul2、dfrA1 的豐度[47]；高濃度的四環素能增加tetX 的含量[48]。但抗生素對ARGs 的選擇作用并非完全嚴格對應，某些抗生素對ARGs 的選擇作用具有交叉性[8]，如氯霉素類抗生素與氨基糖苷類ARGs 的共現[49]，加入氨芐青霉素（一種β-內酰胺類抗生素）后多種非β-內酰胺類ARGs 共現，并為大腸桿菌的抗性作出貢獻[50]。但也有學者觀察到進水濃度較高的環丙沙星并未造成特定耐藥基因的富集[51]，可能存在選擇滯后性或與其他抗生素的共選擇[52]。用多種抗生素藥物篩選時，可以看到不同ARGs 的富集，且殺菌抗生素對ARGs 的富集效果比抑菌抗生素更強[53]。此外，某些抗生素還會影響ARGs 的HGT。例如，痕量四環素能增加污泥中tetA 和tetG 等四環素類抗性基因含量以及HGT 潛能，而高濃度四環素反而對HGT 產生抑制作用[54]。

4.2 非抗生素選擇

重金屬[55]、芳香化合物[56]、非抗生素藥物[57]、納米顆粒[58]等廢水中常見或新興的污染物質也會影響ARGs 的賦存和轉移特征。由于重金屬不易被降解，會在環境中構成持續的選擇壓，可能對抗生素抗性具有更重要的選擇性[59]。因此，重金屬協同選擇細菌抗生素抗性的課題一直備受關注。越來越多的研究證明，抗生素抗性水平隨重金屬污染水平的增加而增加。例如，Stepanauskas 等[55]在微宇宙試驗中發現水中抗生素抗性檢出頻率隨重金屬暴露濃度的升高而升高；Komijani 等[60]研究重金屬對湖泊中ARGs 分布特征的影響后指出，ARGs 的豐度與釩等重金屬濃度的相關性強于抗生素，湖泊重金屬污染增強了細菌對各種抗生素的耐藥性。此外，重金屬和抗生素的抗性基因與MGEs 的共同關聯有助于基因協同傳播[61]，部分重金屬抗性基因（HMRGs）與intI1 基因具有相關性[62]，會影響ARGs 的HGT。

非抗生素類有機物廣泛存在于農藥、染料、藥物的生產廢水中，具有難降解、高毒性等特點。由于芳香化合物降解基因（ADGs）與多重耐藥類、β-內酰胺類等ARGs 在細胞基因組中具有高共現性[63]，因此芳香族化合物可顯著影響ARGs 的種類與豐度[56]。此外，ARGs 的HGT 也受有機物的影響。非抗生素藥物卡馬西平[52]以及氨基類芳香化合物（PAP）、硝基類芳香化合物（PNP）、苯酚(PhOH)[61]、印染染料[56]等有機物，能通過增加活性氧水平、增強細胞膜通透性、調控質粒復制等方式促進HGT。納米顆粒（NPs）與ARGs 作用關系復雜，NPs 能促進ARGs的接合、轉導，造成富集與傳播[64]，但也有研究表明銀納米顆粒等NPs 能有效去除ARGs[65]。此外，同為新興污染物的微塑料能促進ARB 增殖[66]，對ARGs 的富集和HGT 具有促進作用[67]。由于能壘較低，微塑料對于eARGs 的吸附作用強于iARGs，對eARGs 的HGT 的促進作用也更強，對eARGs 的富集倍數高達iARGs 的13.1 倍[68]。也有研究表明，微塑料對二沉池出水中ARGs 的富集能力顯著高于進水與污泥中的ARGs[69]。

4.3 環境因素及水質條件

污水處理廠的運行受外界環境條件及進水水質的影響，如溫度、生化需氧量（BOD5）、化學需氧量（COD）、氨氮濃度等，這些因素同樣影響ARGs 的賦存及HGT。學者觀察到ARGs 的豐度與溫度存在顯著相關性[70-71]，但溫度如何影響ARGs 豐度的變化尚未有明確結論。例如，有研究測得污水處理廠中溫度與bla、mcr等ARGs 豐度成反比[72]，與ermB、sul2豐度成正比[73]。此外，ARGs 的轉移特征同樣受到溫度的影響：夏季較高的溫度可能有利于某些基因的VGT，冬季的低溫可能對HGT 更有利[28]。水質條件中氨氮和COD 對ARGs 影響較大。研究發現，blaPSE-1、tetC、ermB 等基因豐度與污水、污泥中氨氮濃度呈明顯正相關[23]；較高的COD 或能促進耐藥菌的繁殖，通過提高轉化幾率來改變ARGs 的豐度[74]。此外，Liu 等[75]研究發現將廢水鹽度增加到1% 時，ARGs 的總體豐度會大幅度降低，膜生物反應器（MBR）中4% 的鹽度會使sul2、tetG 等基因豐度降低1/2。可能的原因是鹽度降低了敏感菌落的豐度，使其攜帶的ARGs 豐度也隨之降低[3]。

4.4 操作參數及處理工藝

污水處理系統的運行受人工調控，因此操作參數對ARGs 的影響也是研究的重點。研究表明，增加混合液懸浮固體（MLSS）濃度、溶解氧（DO）濃度和污泥停留時間（SRT）可提升ARGs 的去除率[17]，因此，具有較高MLSS 濃度、較長SRT 以及較低污泥負荷（F/M）的MBR工藝對ARGs 的去除效果優于氧化溝工藝[26,66-67]及其他傳統生物處理工藝[76]。DO 濃度是ARGs 的關鍵影響因素，但其影響機制仍需進一步探究。研究表明相比厭氧工藝，好氧工藝對ARGs 的去除率高。但氧氣也可能加劇ARB 的繁殖，厭氧缺氧狀態或能抑制ARGs 的傳播，如厭氧MBR 工藝展現出優越的ARGs 去除性能[77]。厭氧與好氧綜合運用方能提升ARGs 的去除率。

除了常規的生化處理外，為提升出水水質污水處理廠還設置了膜分離、消毒、高級氧化技術（AOPs）等三級處理工藝，這些工藝同樣能夠影響ARGs 的賦存和傳播。如膜濾等物理手段能夠大量去除ARB 且抑制ARG 的釋放[78]，膜濾與混凝沉淀結合能夠進一步提升處理出水ARGs 去除效果[79]，電化學消毒、微生物燃料電池(MFCs)等技術能顯著降低廢水中的ARGs 豐度[53]。氯消毒雖然能氧化除去部分ARGs，但同時也會造成細胞裂解死亡釋放ARGs，還可能促進ARGs 宿主的繁殖[80]，對ARGs的去除率影響不一[81]。有研究發現氯消毒后tetG、sul1、intI1 基因失活、豐度下降[82]，也有研究表明tetW、tetO、sul1 等基因消毒后豐度不變[25]，而Shi等[83]則發現氯消毒后ampC、ermB 等亞型富集。紫外線(UV)消毒常和氯消毒配合使用，二者聯用的效果比單獨氯消毒效果要好[84]。

AOPs 對ARGs 的去除有一定效果。其中Fenton 技術能使ARGs 絕對豐度下降2～3 個數量級，遠優于生物處理工藝[85]；UV-AOPs能夠通過自由基去除細胞胞外聚合物，相比UV 能極大程度降解ARGs[86]。對比UV、臭氧、Fenton 和Fenton/UV 4 種AOPs 后發現，Fenton 和Fenton/UV的效果最佳，能去除tetQ 和ermB 以及大部分ARGs[87]。ARBs 的去除與ARGs 的去除常存在矛盾[88]，需選擇合適的AOPs 手段與使用條件，并進一步改進現有技術[89]。污水處理廠中ARGs 分布和轉移的主要影響因素見表2。

表2 污水處理廠中ARGs 分布和轉移的主要影響因素Table 2 Main influencing factors of ARGs distribution and transfer in WWTPs

5 結論與建議

抗生素抗性問題被世界衛生組織列為全球健康最大威脅之一，新型冠狀病毒感染疫情以來，對于廢水中病原體及ARGs 等生物類污染物質的監測與深度處理得到越來越高的重視。耐藥微生物及ARGs 的廣泛存在與轉移傳播對自然環境及人體健康安全造成了重大威脅。筆者綜述了國內外城市污水處理廠中的常見ARGs 的賦存與轉移特征，得出主要結論：1）磺胺類、四環素類、大環內酯類抗生素廣泛存在于全球城市污水處理廠中；2）城市污水處理廠對各類ARGs 的去除率不一，其中四環素類、大環內酯類等ARGs 去除率較高；氨基糖苷類、多藥類的去除率較低；3）HGT 是活性污泥ARGs 主要的轉移方式，胞內和胞外2 種ARGs 具有不同的HGT 途徑；4）抗生素等污染物、環境因素與水質條件、操作參數與工藝因素通過改變微生物活性等方式對ARGs 的豐度和傳播產生影響。

立足于研究現狀，對后續研究提出以下建議：1）進一步識別具有指示作用的ARGs，從而降低監測ARGs 的成本，以普及ARGs 的監測與控制；2）構建涵蓋污水水質、環境因素、操作參數等影響因素與ARGs（包括iARGs 和eARGs）豐度、種類及水平轉移機制綜合模型，定量分析各因素對ARGs 的影響；3）加強對處理后豐度仍較高的ARGs 的環境風險評價研究，制定與ARGs 有關的排放標準與質量保證標準。