臍帶間充質干細胞改善自身免疫性肝炎免疫微環境的機制

余麗娜 閻升光 謝丹 高升 葉政 陳姿任 王梓樺 歐陽石

1華北理工大學公共衛生學院（河北唐山 063210）；廣東高校生物靶向診治與康復重點實驗室，廣州醫科大學附屬第五醫院2感染科，3中醫科，4超聲科，5急診科（廣州 510700）

自身免疫性肝炎（autoimmune hepatitis，AIH）是T 細胞介導的慢性免疫炎癥性疾病，女性多發，表現為高丙種球蛋白血癥、血清抗核抗體和/或抗平滑肌抗體的存在，以及界面性肝炎［1］。肝臟移植是AIH 發展為肝硬化不可避免的治療選擇，但因其來源難且復發率高已嚴重危害患者生命［2］。因此，開發安全有效的藥物以提供有效的治療方案是至關重要的。

臍帶間充質干細胞（UCMSCs）因其具有針對先天和適應性免疫系統中的免疫細胞的免疫調節特性，同時因其來源廣、免疫原性低等優勢已成為自身免疫性疾病的臨床應用的最佳選擇［3］。研究發現，UCMSCs 可通過對CD4+T 細胞分化的免疫調節，糾正Th17/Treg 的不平衡［4］。Th17/Tregs 免疫平衡在免疫介導的AIH 發病中至關重要。Tregs 作為CD4+T 細胞的一個亞群，通過釋放抗炎因子如TGF-β1 來執行免疫抑制功能。當AIH 疾病活動時，Treg 的數量明顯減少，血清中IL-17 和IL-6 以及肝臟內Th17 細胞的頻率明顯增加［5］。因此，以Treg/Th17 免疫平衡為目標可能為治療AIH 提供一種有效的方法。然而，UCMSCs 調節AIH 免疫微環境中Th17/Treg 平衡的影響和分子機制的基礎和臨床研究卻很少。

因此，本實驗首先用PBMCs 模擬肝臟免疫微環境，觀察UCMSCs 治療對T 淋巴細胞分化的影響。由于Th17/Treg 分化受到復雜的細胞和轉錄因子的調控，進一步通過轉錄譜明確主要的差異基因，為進一步的臨床研究提供理論和數據支持。

1 材料與方法

1.1 UCMSCs 獲得在獲得廣州醫科大學附屬第五醫院醫學倫理委員會的批準（倫理批號：KY01-2021-09-09）及患者的知情同意的情況下，臍帶取自健康足月孕婦，并在2 h 內于本院前沿醫學交叉中心實驗室進行UCMSCs 制備。

1.2 人外周血單個核（PBMCs）獲得在嚴格遵守相關倫理原則的前提下，收集處于血清氨基轉移酶和IgG 水平升高和/或肝組織學炎癥活動的AIH患者外周血樣本。所有研究對象均符合國際自身免疫性肝炎小組（IAIHG）規定的標準和2010 年美國肝病研究學會自身免疫性肝炎診斷與治療指南及評分診斷標準。排除標準：合并PBC 或PSC 的重疊綜合征；2 個月內使用過血液制品；1 個月內接受過糖皮質激素治療或其他免疫抑制治療。

1.3 主要實驗試劑及材料人間充質干細胞無血清培養基（天津灝洋生物）；RPMI 1640 培養基、胎牛血清（FBS）（Gibco）；Transwell 小室（PC 膜，孔徑0.4 μm）（Corning 公司）；流式抗體CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD34、CD31、CD45、HLA-DR、CD25-APC、CD4-FITC、Foxp3-PE、CD3-FITC、CD8α-PerCP-Cy5.5、IL17A-PE（eBioscience 公司）；TGF-1、IL-17 和IL-6 檢測試劑盒（MultiSciences 公司）；RORγt（ab113434）（Abcam 公司）；Foxp3（#12632）、SMAD3（#9523）、p-SMAD3（#9520）、STAT3（#9139）、p-STAT3（#9145）（Cell Signaling Technology 公司）；ECL 超敏化學發光液（美侖生物）；反轉錄試劑盒及TB Green series 試劑盒（日本Takara 公司）。

1.4 實驗儀器Western 電泳槽、轉模槽及化學發光成像系統（美國Bio-rad 公司）；流式細胞儀（美國BD Biosciences 公司）；倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；熒光定量PCR 儀（美國羅氏生物公司）；Agilent 2100 生物分析儀（美國Agilent）；儀器HiSeq X Ten 系統測序平臺（美國illumina 公司）。

1.5 實驗方法

1.5.1 UCMSCs 的制備分離出Wharton 膠并切成1 mm3的泥塊，均勻地鋪在T75 培養瓶中，在無血清培養基中于37 ℃、5% CO2下培養7 d。達到80%匯合度后，對MSC 樣細胞進行傳代。本實驗使用第3 ～6 代UCMSCs。

1.5.2 UCMSCs 的鑒定通過光鏡顯微鏡觀察UCMSCs 的形態特征。在流式細胞儀中使用CD29、CD73、CD90、CD105、CD34、CD31、CD45 和DR 抗體對UCMSCs 進行免疫表型鑒定。

1.5.3 PBMCs 的制備采用Ficoll-Hypaque 密度梯度離心法從AIH 患者外周血中分離PBMCs。在單個核細胞分離液液面加入用PBS 稀釋的新鮮肝素抗凝全血，水平離心（800g，20 min，升降3）。可見血漿層與分離液層之間有一層薄較致密白膜為PBMCs，小心吸取白膜到含10%FBS 的1640 培養基中，離心去上清，洗滌兩次，制成懸液。

1.5.4 構建UCMSCs/PBMCs 共培養系統將UCMSCs 接種于Transwell 小室上腔，PBMCs 細胞接種于下腔，細胞穩定后將UCMSCs 與PBMCs 共培養。UCMSCs/PBMCs 共培養系統分為3 組，包括PBMCs組、Co-culture 1 組（PBMCs∶UCMSCs=10∶1）和Coculture 2 組（PBMCs∶UCMSCs=5∶1）。共培養72 h后，收集PBMCs 和上清液進行后續分析。

1.5.5 流式細胞術檢測Treg 和Th17 細胞的百分比PBMCs 用熒光偶聯抗體著色，再用流式細胞儀進行分析。CD25+Foxp3+CD4+Treg 細胞先用CD4-FITC 和CD25 - APC 標記，Foxp3 抗原透化。CD3+CD8-IL-17A+Th17 細胞通過CD3-FITC 和CD8α-PerCP-Cy5.5 識別CD4+T 細胞，固定透化后用IL17A-PE 染色。

1.5.6 酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測相關細胞因子使用ELISA 試劑盒測定TGF-β1、IL-17 和IL-6 水平。在酶標儀測量450、630 nm 處的光學吸光度。

1.5.7 RNA 測序分析用TRIzol 對PBMCs 進行RNA 提取。Oligo（dT）磁珠富集mRNA。用mRNA的短片段作為模板，合成cDNA。經過純化、末端修復和添加A-tail 后，進行PCR。使用Agilent 2100 分析儀對構建的文庫進行了質量檢查。使用HiSeq X Ten 系統對RNA 進行測序。轉錄組測序分析及生信富集分析由北京百邁客生物科技有限公司完成。設置參數：表達量倍數變化比值＞2和＜0.5 富集，差異有統計學意義（FC＞2 or FC＜0.5，P＜0.05）。

1.5.8 蛋白質-蛋白質相互作用網絡（PPI）使用STRING 11.0 數據庫（https：//string-db.org/）分析差異表達基因，最小有效結合分數為0.4。PPI 網絡是用Cytoscape 3.6.1 軟件構建的。CytoHubba 插件被用來尋找網絡結構中的核心差異基因。

1.5.9 Western blot用含PMSF 和磷酸酶抑制劑的RIPA 提取PBMCs 總蛋白。SDS-PAGE 分離變性的蛋白質并將其轉移到PVDF 膜上。5% BSA 封閉2 h，相應一抗4 ℃孵育過夜。二抗室溫孵育。在成像系統下使用ECL 對所得印跡進行可視化。

1.5.10 RT-qPCR 檢測轉錄基因采用Trizol 法提取細胞總RNA，按Takara 說明書合成cDNA 及PCR 體系，最后結果以2-ΔΔCt分析。Foxp3、RORγt、SMAD3、STAT3 及GAPDH 的引物序列，見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.6 統計學方法本實驗統計分析用SPSS 26.0處理；GraphPad 9.5 版進行相關繪圖工作。數據以（）表示。多組間的平均值使用單因素方差分析，然后用Dunnet-t檢驗對各Co-culture 組和PBMC組之間進行分析。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 UCMSCs 的形態和表面分子鑒定UCMSCs形態在顯微鏡下可見均勻分布，呈現出典型的紡錘形和渦旋狀排列。見圖1。

圖1 UCMSCs 鏡下形態（50 ×，200 ×）Fig.1 Morphology of UCMSCs under microphone（50×，200×）

流式細胞術分析UCMSCs 的表面標記，CD29、CD73、CD90 和CD105 為陽性，而CD31、CD34、CD45和HLA-DR 為陰性，幾乎不表達。符合國際細胞協會MSC 標準。見圖2。

圖2 UCMSCs 細胞表面標記Fig.2 Facing marker of UCMSCs

2.2 UCMSCs 治療對Th17/Treg 平衡的影響Coculture 組與PBMCs 組相比，Th17 細胞比例、Th17/Treg 值明顯減少（P＜0.05），Co-culture 2 組Th17細胞比例顯著降低（P＜0.001）；Treg 細胞比例在Co-culture 2 組明顯增加（P＜0.01）。見圖3、4及表2。

圖3 CD3+CD8-IL-17A+ Th17 細胞比例Fig.3 Frequency of CD3+CD8-IL-17A+ Th17 cells

圖4 CD25+Foxp3+CD4+ Treg 細胞比例Fig.4 Frequency of CD25+Foxp3+CD4+ Treg cells

表2 不同組間Th17、Treg 及Th17/Treg 值Tab.2 Th17，Treg and Th17/Treg values among different groups ±s

表2 不同組間Th17、Treg 及Th17/Treg 值Tab.2 Th17，Treg and Th17/Treg values among different groups ±s

注：與PBMC 組相比，**P＜0.01，***P＜0.001

組別PBMC 組Co-culture 1 組Co-culture 2 組F 值P 值例數3 3 3 Th17（%）4.17 ± 0.35 3.05 ± 0.05**2.53 ± 0.25***33.21＜0.001 Treg（%）1.80 ± 0.10 2.13 ± 0.12 3.17 ± 0.51**15.94 0.004 Th17/Treg 2.31 ± 0.07 1.43 ± 0.06***0.81 ± 0.07***383.05＜0.001

2.3 UCMSCs 治療對TGF-β1、IL-17 和IL-6 的影響與單純PBMCs 組上清液相比，Co-culture 2 組促炎因子TGF-β1 顯著升高（P＜0.01），IL-17、IL-6下降（P＜0.05）。見表3。

表3 不同組上清中的TGF-β1、IL-17 及IL-6 的表達水平Tab.3 TGF-β1，IL-17 and IL-6 expression in the supernatants in different groups ±s，pg/mL

表3 不同組上清中的TGF-β1、IL-17 及IL-6 的表達水平Tab.3 TGF-β1，IL-17 and IL-6 expression in the supernatants in different groups ±s，pg/mL

注：與PBMC 組相比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001

組別PBMC 組Co-culture 1 組Co-culture 2 組F 值P 值例數5 5 5 TGF-β1 3.73 ± 1.73 2.48 ± 1.97 9.84 ± 2.69**16.49＜0.001 IL-17 2.29 ± 1.29 0.78 ± 0.34 0.25 ± 0.18*5.55 0.043 IL-6 1 192.04 ± 65.48 1 029.57 ± 100.72*876.97 ± 82.78***17.49＜0.001

2.4 UCMSCs 治療對RORγt 和Foxp3 的影響Western blot 和RT-PCR 檢測Foxp3 和RORγt 的蛋白和基因表達水平，顯示Foxp3 明顯增加，RORγt明顯下降（P＜0.05）。見圖5。

圖5 UCMSCs 治療對RORγt 和Foxp3 的影響Fig.5 Effect of UCMSCs treatment on RORγt and Foxp3

2.5 轉錄組測序技術分析對照組和共培養組PBMCs 中的差異基因表達經UCMSCs 治療后，較AIH 患者PBMCs 細胞出現93 個上調差異mRNA（FC ≥2，P＜0.05）；95 個下調差異mRNA（FC ≤0.5，P＜0.05），本研究只富集前15 個表達量最高的mRNA 進行后續分析。見圖6。

圖6 差異基因mRNA 韋恩圖Fig.6 Venn diagram of differential gene mRNA

2.6 轉錄組測序技術分析對照組和共培養組PBMCs 中的差異基因表達通過對UCMSCs 對PBMCs 的前15 組轉錄系主要作用通路進行統計學富集分析。發現差異mRNA 富集的變化集中在免疫應答、淋巴細胞分化/激活以及T 細胞的激活調整等領域。見圖7。

圖7 共有差異mRNA 富集圖（前15 位）Fig.7 Total differential mRNA enrichment map（top 15）

2.7 PP 網絡構建、關鍵轉錄基因篩選蛋白質互作網絡（Protein-Protein Interaction Networks，PPI）圖顯示Co-culture 組與PBMC 組相比，SMAD3 的表達量增加而STAT3 的表達量減少，并可見其表達占比高。見圖8。

圖8 AIH 差異表達基因編碼蛋白網絡互作圖Fig.8 PPI of AIH differentially expressed genes encoding

2.8 UCMSCs 治療促進STAT3 下調和SMAD3 上調結合上述結果，我們進一步論證SMAD3 和STAT3 的激活，以其磷酸化狀態為標志。當UCMSCs：PBMCs 為1∶5 時，Western blot 結果顯示STAT3 磷酸化（p-STAT3）明顯下調（P＜0.01），p-SMAD3 則上調（P＜0.05）。一致的是，SMAD3 mRNA 水平在Co-culture 2 組中明顯高于PBMC 組（P＜0.001），而STAT3 mRNA 水平減少（P＜0.001）。見圖9。

圖9 UCMSCs 治療對STAT3 和SMAD3 的影響Fig.9 Effect of UCMSCs treatment on STAT3 and SMAD3

3 討論

研究證實，UCMSCs 因其免疫調節特性可將適應性細胞從以效應性T 細胞（Th17 cells）為主的炎癥環境調節到富含Tregs 的微環境。本研究結果顯示，UCMSCs 與從AIH 患者外周血提取的PBMCs共培養時，UCMSCs 可促使Th17 細胞分化為Tregs，TGF-β1 釋放增加，Th17/Treg 值下降，IL-17 和IL-6的釋放顯著減少，提示UCMSCs 治療可逆轉Th17/Tregs 免疫失衡，改善AIH 免疫微環境。Th17/Tregs免疫失衡在AIH 的發展中起著重要作用。臨床研究［8］顯示，AIH 患者的外周血中Th17 細胞的比例高于CD4+T 細胞，與肝損傷呈正相關關系。RORγt 是一種促進Th17 細胞分化的轉錄因子［9］。研究［10］表明，當低濃度的TGF-β1 與IL-6 同時存在時，能夠通過激活STAT3 磷酸化誘導RORγt 表達，從而誘導CD4+T 細胞向Th17 細胞分化。Treg 對免疫介導的炎癥反應有明顯的負向調節作用，對維持免疫平衡和調節自身免疫反應至關重要。轉錄因子Foxp3 作為Treg 分化標志物，也是識別CD25+Foxp3+CD4+Treg 細胞的特異性標志物。進一步研究發現UCMSCs 治療可上調Foxp3 表達，減少RORγt 表達。

為進一步探索UCMSCs 治療AIH 免疫微環境的潛在作用機制，采用RNA 測序和生物信息分析研究主要作用通路，其中SMAD3 和STAT3 占據核心位置。再通過實驗結果顯示UCMSCs 治療主要通過上調p-SMAD3，下調p-STAT3 來介導PBMCs中的Th17/Treg 免疫平衡。機制研究發現，轉化生長因子β1（TGF-β1）［11］是維持免疫耐受的真正關鍵，通過啟動TGF-β 信號通路在Tregs 和Th17 細胞的分化中起著關鍵作用。TGF-β1 可使下游的SMAD 蛋白磷酸化，誘導SMAD 蛋白在細胞核中聚集，并作為轉錄因子進行轉錄調節［12］。

綜上，在大劑量UCMSCs 治療后，可明顯下調Th17/Treg 值，促進TGF-β1 含量，增強SMAD3 表達，誘導Treg 細胞的分化和增殖；降低STAT3 表達，減少Th17 細胞的分化和生成。為臨床試驗的開展提供數據支持。