基于Hedgehog信號(hào)通路探討祛濕通絡(luò)法抗非酒精性脂肪性肝病肝纖維化研究

劉穎，高展翔

（福建中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，福建 福州 350122）

非酒精性脂肪性肝?。╪on-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）肝纖維化由非酒精性脂肪性肝炎發(fā)展而來(lái)，隨著病情進(jìn)一步惡化，可發(fā)展為肝硬化，甚至肝癌［1］。研究表明，各種慢性肝病都可能伴有肝纖維化，12%～25%的慢性乙型肝炎肝纖維化患者5年內(nèi)可進(jìn)展為肝硬化［2］，嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康，因此及時(shí)逆轉(zhuǎn)及阻斷肝纖維化進(jìn)展具有重大意義。但目前為止，臨床仍缺乏療效肯定的抗肝纖維化藥物。中藥具有多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn)，對(duì)病理機(jī)制復(fù)雜的疾病可發(fā)揮綜合優(yōu)勢(shì)，實(shí)踐也證明中醫(yī)藥在抗器官纖維化中發(fā)揮了重要作用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，“茵陳三甲散”對(duì)防止非酒精性脂肪肝向肝纖維化轉(zhuǎn)變有滿意效果，而其作用機(jī)制尚不明確。本研究以Hedgehog（簡(jiǎn)稱(chēng)Hh）信號(hào)通路為靶點(diǎn)，研究“茵陳蒿湯”和“薛氏三甲散”及其合方“茵陳三甲散”干預(yù)NAFLD肝纖維化慢性炎癥的過(guò)程，從而探究祛濕通絡(luò)法作用于NAFLD肝纖維化的可能機(jī)制。

1 材 料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 8周齡SPF級(jí)C57BL/6J成年雄性小鼠60只，體質(zhì)量（18±2）g，購(gòu)自杭州醫(yī)學(xué)院，許可證號(hào)為：SCXK（浙）2019-0002。在福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)飼養(yǎng)室飼養(yǎng)，合格證號(hào)為：SYXK（閩）2019-007。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 中藥（茵陳、梔子、大黃、醋鱉甲、炮山甲、?蟲(chóng)、僵蠶、柴胡、桃仁）購(gòu)自福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬福建省第三人民醫(yī)院；秋水仙堿（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：A05GS144308）。蛋氨酸膽堿缺乏（methionine-choline-deficient，MCD）飼料（無(wú)錫帆泊生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：FB-A020820 02B）。

1.3 主要實(shí)驗(yàn)試劑 天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、總膽紅素（TBIL）、透明質(zhì)酸（HA）、層黏蛋白（LN）、Ⅲ型前膠原肽（PCⅢ）酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)：C010-2-1、C009-2-1、C019-1-1、H141-1-1、H148、H491-1）；HE染色液、Masson染色液（珠海貝索生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：BA4025、BA4079）；BCA蛋白定量試劑盒、Western blot專(zhuān)用一抗和二抗稀釋液（武漢博士德生物工程有限公司，批號(hào)：AR0198、AR1017）；qPCR檢測(cè)試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司，批號(hào)：Q311-02）。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器 顯微鏡DM4000 B-LED（德國(guó)徠卡公司）；上轉(zhuǎn)發(fā)光免疫分析儀UPF-3A（北京熱景生物技術(shù)有限公司）；PCR儀（杭州米歐儀器有限公司）；轉(zhuǎn)移脫色搖床（海門(mén)其林貝爾儀器制造公司）；超微量紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（杭州米歐儀器有限公司）；冷凍離心機(jī)（廣州吉迪儀器有限公司）；瓊脂糖水平電泳儀（北京六一生物科技有限公司）。

2 方 法

2.1 實(shí)驗(yàn)藥物制備 茵陳蒿湯由茵陳18 g，梔子12 g和大黃6 g組成；薛氏三甲散由?蟲(chóng)10 g，醋鱉甲15 g，炮穿山甲3 g，僵蠶10 g，柴胡5 g和桃仁10 g組成；自擬方茵陳三甲散由茵陳18 g，梔子12 g，大黃6 g，醋鱉甲15 g，炮山甲3 g，?蟲(chóng)10 g，僵蠶10 g，柴胡5 g和桃仁10 g組成。將上述中藥浸泡、煎煮、過(guò)濾、濃縮配制成藥液（茵陳蒿湯濃度為0.7 g/mL、薛氏三甲散藥液濃度1.1 g/mL、茵陳三甲散藥液濃度1.8 g/mL），存于4 ℃冰箱里。

2.2 模型建立與評(píng)價(jià) 將小鼠分為正常組10只和造模組50只，造模組使用MCD飼料建立模型。MCD飼料造模是目前國(guó)際上公認(rèn)的NAFLD造模方法，根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)造模成功案例［3-4］，光鏡下觀察模型組肝組織形態(tài)學(xué)改變，出現(xiàn)肝組織結(jié)構(gòu)紊亂，肝細(xì)胞脂肪樣變、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)和肝細(xì)胞水腫，點(diǎn)灶狀壞死、竇周纖維化，中央靜脈區(qū)有大量膠原纖維沉積，表示造模成功。

2.3 動(dòng)物分組及干預(yù) 將小鼠用隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、模型組、西藥組、祛濕組、通絡(luò)組、祛濕通絡(luò)組，每組各10只。根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)體質(zhì)量劑量折算表［5］，正常組和模型組給予10 mL/kg蒸餾水灌胃；祛濕組按7.4 g/kg茵陳蒿湯灌胃；通絡(luò)組按10.9 g/kg薛氏三甲散灌胃；祛濕通絡(luò)組按18.3 g/kg自擬方茵陳三甲散灌胃；西藥組按0.1 mg/kg秋水仙堿灌胃。于每日上午9時(shí)灌胃，每日1次，連續(xù)8周。

2.4 標(biāo)本采集 末次灌胃結(jié)束，各組小鼠禁水、禁食12 h后稱(chēng)體質(zhì)量。采用腹腔注射20%烏拉坦深度麻醉，摘取眼球取血，分離血清（3 000 r/min，15 min）置于-20 ℃低溫冰箱保存。分別取肝左葉組織放于凍存管和4%多聚甲醛中，凍存管先置于液氮內(nèi)保存，隨后放入-80 ℃冰箱內(nèi)。

2.5 觀察指標(biāo)

2.5.1 肝功能及肝纖維化指標(biāo)測(cè)定 ELISA法分別檢測(cè)各組小鼠肝功能指標(biāo)AST、ALT、TBIL及肝纖維化指標(biāo)HA、LN、PCⅢ水平，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)上的操作步驟進(jìn)行。

2.5.2 肝組織病理學(xué)觀察 取約1 cm×1 cm×1 cm大小肝組織，生理鹽水沖洗后放入40 g/L甲醛液中固定，固定后乙醇梯度脫水，二甲苯透明后浸蠟及包埋，制作病理切片。染色后，光鏡下觀察各組小鼠肝組織病理形態(tài)變化。

2.5.3 qPCR檢測(cè) 稱(chēng)取100～150 μg的肝組織塊，用TRIpure裂解液離心提取RNA，加入等體積的異丙醇，12 000 r/min 4 ℃離心5 min，棄掉上清，超凈臺(tái)干燥沉淀2～5 min，加入RNase-free water溶解沉淀，-80 ℃保存。RNA電泳：稱(chēng)取0.25 g瓊脂糖粉，加入25 mL的1×TBE緩沖液，放入微波爐中煮沸30 s，重復(fù)4～5次，煮沸結(jié)束后加1.5 μL核酸染料，倒入制膠盒內(nèi)，等待凝固。取4 μL的RNA樣本和2 μL的1×Loading buffer 進(jìn)行混合上樣，200 V，10 min。從NCBI上查找小鼠的Shh、Gli1、Gli2、α平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）等基因的mRNA序列，并以相應(yīng)種屬的GAPDH作為內(nèi)參基因，根據(jù)引物設(shè)計(jì)的原則，用Premier 5.0設(shè)計(jì)目標(biāo)基因和內(nèi)參基因的特異性引物，由上海博尚生物工程技術(shù)有限公司進(jìn)行合成，見(jiàn)表1。用2-ΔΔCt進(jìn)行進(jìn)一步定量分析。

表1 引物序列

2.5.4 Western blot檢測(cè)小鼠肝組織中Gli1、Gli2、Shh、α-SMA蛋白表達(dá)量 稱(chēng)取100～150 μg的組織塊，放入含有磁珠的2 mL研磨管中。每管加1 mL的含PMSF的RIPA裂解液（RIPA裂解液：PMSF＝1 000∶1）置于研磨機(jī)粉碎。離心后取上清液，BCA法進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定，記錄數(shù)據(jù)。取等量蛋白（10 μg）進(jìn)行10% SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜、封閉后，室溫孵育2 h，用一抗、二抗稀釋液稀釋一抗到工作濃度，將膜置于一抗溶液中，置搖床室溫孵育2 h。將膜置于TBST中，漂洗3次，10 min/次。根據(jù)一抗來(lái)源選擇合適的二抗，用一抗、二抗稀釋液稀釋HRP標(biāo)記的二抗到工作濃度（1∶5 000），室溫孵育2 h。TBST洗膜（10 min×3次），顯影并分析。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SPSS 26.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。計(jì)量資料服從正態(tài)分布用（）表示，2組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 6組小鼠一般狀態(tài) 在實(shí)驗(yàn)前，各組小鼠精神狀態(tài)好，活動(dòng)能力強(qiáng)，毛色有光澤。隨著天數(shù)的推移，模型組小鼠出現(xiàn)形體消瘦，皮毛紊亂欠光澤，活動(dòng)減少，反應(yīng)遲緩，攝食量減少。至實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，正常組毛色光澤、飲食如常、活潑好動(dòng)、體型正常；模型組小鼠明顯出現(xiàn)食欲減退，形體瘦弱，體質(zhì)量減輕，毛色暗，毛發(fā)紊亂無(wú)光澤，精神萎靡，呈現(xiàn)疾病狀態(tài)；西藥組、祛濕組、通絡(luò)組、祛濕通絡(luò)組小鼠的活動(dòng)頻率、皮毛光澤度較模型組有不同程度的好轉(zhuǎn)，攝食一般。

3.2 6組小鼠血清AST、ALT、TBIL、HA、LN及PCⅢ水平變化 見(jiàn)表2。

表2 6組小鼠血清AST、ALT、TBIL、HA、LN及PCⅢ指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果（）

表2 6組小鼠血清AST、ALT、TBIL、HA、LN及PCⅢ指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果（）

注：與正常組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05；與西藥組比較，3） P＜0.05；與祛濕組比較，4） P＜0.05；與通絡(luò)組比較，5） P＜0.05。

組別正常組模型組西藥組祛濕組通絡(luò)組祛濕通絡(luò)組PCⅢ/（ng/mL）3.80±0.20 20.00±2.401）11.40±0.902）7.70±0.302）3）8.30±0.502）3）5.50±0.302）3）4）5）n 10 10 10 10 10 10 ALT/（U/L）35.90±2.20 110.40±13.601）65.40±4.302）68.80±6.502）71.50±4.202）48.10±2.802）3）4）5）AST/（U/L）71.10±3.40 159.50±9.101）112.50±11.002）116.60±11.402）109.90±10.502）84.50±2.702）3）4）5）TBIL/（μmol/L）7.60±0.50 37.00±2.401）22.20±1.102）14.60±0.702）3）15.70±0.802）3）12.60±0.502）3）4）5）HA/（U/L）237.00±6.60 550.90±4.601）426.60±16.102）326.30±13.402）3）330.50±22.102）3）289.70±11.002）3）LN/（μg/mL）7.30±1.00 94.40±6.401）58.70±5.402）34.70±4.102）3）26.50±0.902）3）17.40±1.202）3）4）5）

3.3 6組小鼠肝臟病理形態(tài)變化比較 通過(guò)HE和Masson染色進(jìn)行觀察，正常組肝組織結(jié)構(gòu)清晰，肝小葉完整，細(xì)胞形態(tài)正常，肝細(xì)胞索排列整齊，無(wú)炎癥，無(wú)纖維化。肝纖維化模型組小鼠肝組織正常結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，有肝細(xì)胞脂肪樣變、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)和肝細(xì)胞水腫，點(diǎn)灶狀壞死，肝纖維增生。西藥組肝纖維化情況有所好轉(zhuǎn)，細(xì)胞水腫、排列較紊亂，肝細(xì)胞壞死減少，脂肪空泡減少，炎癥減輕，少量纖維組織增生。病理染色發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，祛濕組、通絡(luò)組和祛濕通絡(luò)組肝纖維化的現(xiàn)象均有所好轉(zhuǎn)，纖維增生減少，肝細(xì)胞壞死程度減輕，脂肪空泡減少，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少，其中祛濕通絡(luò)組脂肪變、水腫、肝細(xì)胞壞死和纖維增生較模型組明顯減少。見(jiàn)圖1。

圖1 6組小鼠肝組織病理形態(tài)變化圖（HE、×100；Masson、×100）

3.4 6組小鼠肝組織中Shh、Gli1、Gli2、α-SMA mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 見(jiàn)表3。

表3 6組小鼠Gli1、Gli2、Shh、α-SMA mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較（）

表3 6組小鼠Gli1、Gli2、Shh、α-SMA mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較（）

注：與正常組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05；與西藥組比較，3） P＜0.05；與祛濕組比較，4） P＜0.05；與通絡(luò)組比較，5） P＜0.05。

組別正常組模型組西藥組祛濕組通絡(luò)組祛濕通絡(luò)組α-SMA 1.04±0.03 2.03±0.031）1.71±0.022）1.48±0.022）3）1.48±0.012）3）1.28±0.012）3）4）5）n 10 10 10 10 10 10 Gli1 1.11±0.03 1.99±0.021）1.78±0.032）1.51±0.022）3）1.51±0.052）3）1.25±0.022）3）4）5）Gli2 1.06±0.04 2.01±0.041）1.73±0.022）1.50±0.022）3）1.53±0.032）3）1.27±0.022）3）4）5）Shh 1.02±0.03 1.94±0.031）1.76±0.022）1.54±0.022）3）1.53±0.032）3）1.29±0.022）3）4）5）

3.5 6組小鼠肝組織中Shh、Gli1、Gli2、α-SMA蛋白表達(dá)量比較 見(jiàn)圖2。

圖2 6組小鼠肝組織Gli1、Gli2、Shh、α-SMA蛋白表達(dá)量比較

4 討 論

茵陳蒿湯出自漢張仲景《傷寒論》，是治療肝膽濕熱的主方；三甲散乃明末瘟疫學(xué)家吳又可治療伏氣“主客交病”之主方，薛氏三甲散出自薛生白《濕熱病篇》，在吳氏三甲散基礎(chǔ)上演變而來(lái)，針對(duì)濕熱證后期，主客交混，絡(luò)脈凝瘀特點(diǎn)而創(chuàng)立的名方。本研究自擬茵陳三甲散是基于祛濕通絡(luò)立法，以茵陳蒿湯和薛氏三甲散合方而成。全方用藥，清熱祛濕、通絡(luò)化瘀，切中NAFLD肝纖維化主要病機(jī)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)，祛濕通絡(luò)組在與除正常組外各組小鼠進(jìn)行兩兩比較中肝功能指標(biāo)水平和肝纖維化指標(biāo)水平，以及Gli1、Gli2、Shh、α-SMA的mRNA表達(dá)水平及蛋白表達(dá)量均顯著降低（P＜0.05），表明自擬茵陳三甲散在減少肝臟損傷，降低肝纖維化方面最為明顯。肝組織病理變化也說(shuō)明，通過(guò)HE和Masson染色觀察到祛濕通絡(luò)組小鼠肝細(xì)胞脂肪變、水腫、肝細(xì)胞壞死和纖維組織增生較西藥組、祛濕組和通絡(luò)組均減輕（P＜0.05），以上結(jié)果均證實(shí)自擬茵陳三甲散在減輕肝纖維化的程度上效果優(yōu)于秋水仙堿、茵陳蒿湯和薛氏三甲散。

肝纖維化發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，主要病理改變?yōu)楫?dāng)肝臟受到炎癥損傷時(shí)，肝內(nèi)彌漫性細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）的過(guò)度沉積［7］，而肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cells，HSCs）已被證實(shí)是ECM的主要來(lái)源，HSCs激活并轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞（myofibroblast，MFB）是發(fā)展為肝纖維化的中心環(huán)節(jié)［8］，因此抗肝纖維化是各種慢性肝病預(yù)后、轉(zhuǎn)歸的關(guān)鍵所在。研究表明，Hh信號(hào)通路與非酒精性脂肪性肝炎關(guān)系密切，且能夠激活HSCs，導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)生［9］，過(guò)度激活甚至可發(fā)展為肝硬化和肝癌［10］。Hh信號(hào)通路主要由Hh配體、受體（patched、smoothened）和轉(zhuǎn)錄因子Gli1、Gli2和Gli3及其下游靶基因組成［11］。Gli是Hh信號(hào)通路末端的最終轉(zhuǎn)錄效應(yīng)因子，主要作用是促使HSCs轉(zhuǎn)換為肌成纖維細(xì)胞。α-SMA是肝纖維化活化的重要標(biāo)志物。Hh信號(hào)通路在肝臟中高度保守，在調(diào)節(jié)肝組織的生長(zhǎng)、分化、模式化和血管化等方面發(fā)揮著重要作用。本研究顯示，在給予茵陳三甲散灌胃的小鼠肝臟組織內(nèi)Gli1、Gli2、Shh、α-SMA mRNA和蛋白表達(dá)量上均低于除正常組外的其他組。提示基于祛濕通絡(luò)立法的茵陳三甲散對(duì)小鼠肝纖維化的抑制作用優(yōu)于單用茵陳蒿湯或薛氏三甲散，其作用機(jī)制可能與下調(diào)和抑制Gli1、Gli2、Shh、α-SMA的表達(dá)，阻止肝星狀細(xì)胞活化有關(guān)，從而阻斷Hh信號(hào)通路的激活。說(shuō)明祛濕通絡(luò)法對(duì)MCD飼料誘導(dǎo)肝纖維化小鼠具有較好的保護(hù)作用，其作用優(yōu)于單用祛濕法或通絡(luò)法。

綜上，祛濕法或通絡(luò)法對(duì)改善MCD飼料誘導(dǎo)的小鼠NAFLD肝纖維化均有效，但祛濕通絡(luò)法綜合效果最佳，其作用機(jī)制與下調(diào)Gli1、Gli2、Shh、α-SMA的表達(dá)，從而抑制Hedgehog信號(hào)通路的活化有關(guān)。