白藜蘆醇治療潰瘍性結腸炎的網絡藥理學研究及實驗驗證

曹劉菁，吳與倫，張欣然，魏麗慧，沈阿靈，3，彭軍，陳友琴

（1.福建中醫藥大學中西醫結合研究院，福建 福州 350122；2.福建省中西醫結合老年性疾病重點實驗室，福建 福州 350122；3.福建中醫藥大學科技創新與轉化中心，福建 福州 350122；4.美國凱斯西儲大學醫學院，俄亥俄州 克利夫蘭 44106）

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種慢性非特異性腸道炎癥性疾病，是引起結腸炎相關性結腸癌的高危因素［1］。早期防治UC對降低結腸癌的發病率具有重要意義。中醫藥在治療UC中優勢顯著，療效確切，抗炎效果明顯［2］。臨床常用中藥虎杖、桑白皮、土茯苓等具有抗炎作用［3-5］，白藜蘆醇是三者重要的活性成分，研究證實白藜蘆醇具有抗炎、調節免疫等作用［6］，可減輕UC患者的炎癥［7-8］，但其治療UC的作用機制尚有待進一步探討。本研究擬采用網絡藥理學研究探討白藜蘆醇治療潰瘍性結腸炎的相關機制并開展體內實驗驗證，以期闡明白藜蘆醇治療UC的新機制和新靶點，為臨床治療UC藥物的研發提供更多的思路和方向。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 6～8周齡SPF級雄性C57BL/6小鼠18只，體質量（21±3 g）購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，飼養于福建中醫藥大學實驗動物中心屏障系統，使用許可證號：SYXK（閩）2020-0002。

1.2 實驗藥物的配制 通過文獻調研，小鼠按照100 mg/（kg/d）的劑量經口服給藥。白藜蘆醇加入蒸餾水配置成25 mg/mL的混懸液，現配現用。

1.3 實驗試劑 白藜蘆醇（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號：501-36-0）；葡聚糖硫酸鈉（DSS）（美國MP Biomedicals公司，批號：0216011080-100 g），便血（OB）試劑（珠海貝索生物技術有限公司，批號：BA2020B）；蘇木素溶液、伊紅溶液、4%多聚甲醛固定液（北京Solarbio公司，批號：G1140、G1100、LA0427）；Western blot及IP細胞裂解液、ECL發光試劑盒、PMSF（南京碧云天公司，批號：P0013、P0018、P0100）；PhosSTOPTM（德國Roche公司，批號：4906837001）；蛋白Marker、BCA蛋白定量試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific公司，批號：26617、23225）；PVDF膜（德國Millipore公司，批號：ISEQ 00010）；PI3K、p-Akt、Akt抗體（美國Cell Signaling Technology公司，批號：4257、4060、4691）；GAPDH抗體（中國Abbkine公司，批號：ABL1021）。

1.4 實驗儀器 自動脫水機與石蠟包埋機（湖北孝感亞光醫用電子技術有限公司）；全自動石蠟切片機、DM4000B顯微鏡（德國Leica公司）；組織研磨機（上海凈信實業發展有限公司）；Western blot電泳儀、轉膜儀、化學成像系統（美國Bio-Rad公司）。

2 實驗方法

2.1 UC疾病靶點的收集 在DisGenet（http：//www.disgenet.org/）數據庫中，輸入“ulcerative colitis”為檢索詞，搜集UC的相關靶點。

2.2 白藜蘆醇作用靶點預測 在中藥系統藥理學平臺（TCMSP，https：//tcmspw.com/tcmsp.php）、Swiss Target Prediction（http：//www.swisstargetprediction.ch/）、SymMap（http：//www.symmap.org/）、BATMANTCM（http：//bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/）中獲取白藜蘆醇對應的蛋白靶點，在Unitprot數據庫（http：//www.Unitprot.org/）中查找蛋白統一的基因名，以此對檢索得到的蛋白進行校正，從而獲得白藜蘆醇的作用靶點，去掉重復項后，與UC的作用靶點相映射，得到白藜蘆醇治療UC的共同靶點，即為白藜蘆醇治療UC的潛在靶點。

2.3 GO和KEGG富集分析 將預測的作用靶點導入DAVID數據庫（https：//david.ncifcrf.gov/）中進行GO（gene ontology）生物學過程富集分析和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）信號通路富集分析，得到并保存結果。以P＜0.001為篩選條件，并且依據富集基因數的大小進行排序，選擇KEGG通路富集分析中排名前20的通路及GO分類富集分析中排名前10的通路，采用R-Studio軟件中的ggplot2來繪制氣泡圖。

2.4 構建靶點相互作用（PPI）網絡 將白藜蘆醇治療UC的作用靶點導入STRING網絡平臺，物種選擇“homo sapiens”，置信度設定＞0.9，獲取靶點的相互作用關系的信息表格。通過Cytoscape 3.7.2軟件繪制潛在靶點PPI網絡，同時對網絡進行拓撲結構分析，確定白藜蘆醇治療UC的核心靶點。

2.5 小鼠潰瘍性結腸炎模型的構建 通過周期性的自由飲用2%葡聚糖硫酸鈉（DSS）溶液建立慢性UC模型，以21 d為1個周期循環，第1～7天給予2% DSS溶液讓小鼠自由飲用，DSS溶液每2天更換1次，第8～21天更替為蒸餾水，重復2個周期，第43～49天繼續自由飲用2% DSS溶液7天［9］，第50天取材。

2.6 分組與干預 將18只C57BL/6小鼠適應性喂養1周后，隨機分為對照組、模型組和白藜蘆醇組，每組6只。采用“2.5”所示造模法構建慢性UC模型，造模的同時對小鼠進行給藥處理，造模期間白藜蘆醇組給予100 mg/（kg/d）混懸液經口服給藥。對照組和模型組經口服給予等體積的蒸餾水。

2.7 疾病活動指數（disease activity index，DAI）評分計算 造模期間觀察小鼠的體質量、大便的性狀及便血情況，參照JACKSON等［10］的評估標準，計算DAI評分。同時記錄小鼠體質量變化，制作百分比統計圖，體質量均與給藥第1天比較［11-12］。

2.8 組織取材與結腸長度測量 小鼠先經由2%異氟烷麻醉，之后脫頸處死小鼠，在冰上采集結腸組織（從肛門到回盲部為結腸位置），將其分離后拍照、測量，隨后將其剪為3段，將靠近肛門的第1段浸泡于4%多聚甲醛中固定，剩余組織保存至-80 ℃超低溫冰箱。

2.9 結腸組織病理學檢測 取材后的結腸組織，4%的多聚甲醛溶液固定24 h后，經過脫水、透明、浸蠟處理后進行包埋，并將組織切成4 μm的薄片，用載破片承載后烘烤6 h，將其脫蠟至水，進行蘇木精-伊紅（HE）染色，鏡下觀察并拍照。

2.10 組織病理學評分 使用光學顯微鏡觀察HE染色的組織切片并拍照分析，按照表1所示的評分標準從4個方面評估結腸組織病理情況，將每個部分評分相加得到的總分即為組織病理學評分。

表1 組織病理學評分標準

2.11 結腸組織Western blot檢測 取材后的結腸組織樣本加入適量的裂解液，置于組織研磨機上研磨，充分裂解后離心，收集上清，采用BCA法測定蛋白的總濃度，按相同質量的蛋白量進行SDS-PAGE電泳，轉至PVDF膜上，用封閉液室溫封閉1 h。將其置于p-Akt（1∶1 000）、Akt（1∶1 000）、PI3k（1∶1 000）和GAPDH（1∶5 000）一抗中，4 ℃搖床過夜，用含0.2% Tween的TBST洗膜15 min，加入相對應的二抗（1∶5 000）室溫孵育1 h，TBST洗膜15 min，隨后滴加1∶1的ECL發光液，用Bio-Rad凝膠成像儀器掃描成像。

2.12 統計學方法 采用SPSS 26.0統計軟件進行數據處理。計量資料服從正態分布以（）表示，2組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，3組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05表示差異具有統計學意義。

3 結 果

3.1 白藜蘆醇治療UC的潛在靶點 采用DisGenet數據庫檢索疾病靶點，得到UC疾病靶點1 458個，TCMSP數據庫，Swiss Target Prediction數據庫、Sym-Map數據庫、BATMAN-TCM數據庫中獲取白藜蘆醇作用靶點358個。將白藜蘆醇作用靶點與UC疾病靶點相映射，獲得白藜蘆醇可能作用于UC的潛在靶點127個，見圖1。

圖1 白藜蘆醇潛在靶點

3.2 GO功能富集分析 運用DAVID數據庫對白藜蘆醇治療UC的潛在靶點進行GO功能富集分析，通過設定P＜0.001的指標，并根據富集基因數的大小進行排序，整理出排名前10項。GO富集功能分析顯示涉及生物過程（biological process，BP）272個，包括藥物反應、凋亡過程的負調控、衰老、對外界刺激的反應、基因表達、凋亡過程的正調控、細胞遷移的正調控、缺氧反應及過氧化氫反應等，見圖2。細胞組分（cellular component，CC）28個，包括高分子復合物、細胞質、胞質溶膠、細胞外液、膜性小腔、膜筏、細胞表面、細胞外區、細胞核及細胞質膜等，見圖3。分子功能（molecular function，MF）40個，包括酶結合、相同蛋白質結合、轉錄因子結合、血紅素結合、蛋白質結合等，見圖4。

圖2 白藜蘆醇生物過程分析

圖3 白藜蘆醇細胞組分分析

圖4 白藜蘆醇分子功能分析

3.3 KEGG通路分析 采用 DAVID 數據庫對交集靶點進行KEGG通路分析，共得到131條通路，以P＜0.001作為篩選條件，依據富集基因數的大小進行排序，篩選得到了排名前20的通路。這些交集靶點主要富集在PI3K-Akt信號通路、脂質與動脈粥樣硬化、乙型肝炎、糖尿病并發癥的AGE-RAGE通路、TNF信號通路等通路。見圖5。

圖5 KEGG信號通路富集分析結果（前20名）

3.4 潛在靶點PPI網絡的構建與分析 將白藜蘆醇治療UC的127個潛在靶點蛋白錄入到STRING數據庫中，構建蛋白相互作用PPI網絡，得到127個節點，2 627條相互作用關系。使用Cytoscape 3.7.2軟件對PPI網絡數據進行繪制，節點度值的均值為41.37，≥均值的節點有59個；節點介數中心性的均值為0.006 044，≥該介數中心性2倍中位數的節點有35個。共有30個節點的度值和介數中心性均高于均值，包括Akt1、TNF、IL-6、TP53、STAT3、IL-1B、MAPK3和PTGS2等，這些靶點即為白藜蘆醇的核心靶點。見圖6。

圖6 白藜蘆醇核心靶點相互作用網絡

3.5 白藜蘆醇對UC小鼠體質量的影響 對照組小鼠正常飼養，體質量增加；與對照組相比，模型組小鼠體質量顯著降低（P＜0.05）；與模型組小鼠相比，白藜蘆組小鼠體質量顯著升高（P＜0.05）。見圖7。

圖7 白藜蘆醇對UC小鼠體質量的影響

3.6 白藜蘆醇對UC小鼠DAI評分的影響 3組小鼠取材前的DAI評分結果顯示，對照組小鼠DAI評分為0分。與對照組比較，模型組小鼠的DAI評分顯著提高（P＜0.05）；與模型組比較，白藜蘆醇組小鼠DAI評分顯著下降（P＜0.05）。見圖8。

圖8 白藜蘆醇對UC小鼠DAI評分的影響

3.7 白藜蘆醇對UC小鼠結腸長度的影響 與對照組比較，模型組小鼠結腸的長度明顯縮短（P＜0.05）；與模型組比較，白藜蘆醇組小鼠結腸的長度的縮短明顯緩解（P＜0.05）。見圖9。

圖9 白藜蘆醇對UC小鼠結腸長度的影響

3.8 白藜蘆醇對UC小鼠結腸組織病理學的影響 對照組小鼠結腸的黏膜完整，腺體排列規則，未發現炎性細胞浸潤，病理組織學評分為0分。與對照組比較，模型組小鼠結腸組織結構紊亂，腺體排列不規則，出現大量炎性細胞浸潤，病理組織學評分顯著增加（P＜0.05）。與模型組比較，白藜蘆醇組小鼠結腸組織結構趨向正常，腺體排列趨向整齊，炎性細胞浸潤情況明顯減輕，病理組織學評分明顯降低（P＜0.05）。見圖10。

圖10 白藜蘆醇對UC小鼠結腸組織病理學損傷的影響

3.9 白藜蘆醇對UC小鼠結腸組織中PI3K、p-Akt、Akt蛋白的影響 與對照組比較，模型組小鼠結腸組織蛋白中p-Akt/Akt比率明顯升高（P＜0.05），PI3K蛋白表達升高。與模型組比較，白藜蘆醇組小鼠結腸組織蛋白p-Akt/Akt比率明顯下降（P＜0.05），PI3K蛋白表達降低。見圖11。

圖11 白藜蘆醇對UC小鼠結腸組織中PI3K、p-Akt、Akt蛋白的影響

4 討 論

白藜蘆醇具有多種生物活性，可緩解UC癥狀，本研究通過TCMSP、BATMAN-TCM、Swiss Target Prediction、SymMap、DisGenet等多個數據庫的挖掘，篩選并確定白藜蘆醇可能作用于UC的潛在靶點127個。通過KEGG通路分析，富集到PI3K/Akt信號通路、HIF-1信號通路、FOXO信號通路等信號通路。戰晶玉等［13］發現PI3K/Akt信號通路活化后對其下游mTOR的活化有促進作用，從而調控細胞的增殖、凋亡、炎癥因子的分泌和腸道炎癥反應來治療UC。楊顯娟等［14］研究結果證實，PI3K/Akt通路活化后可通過調控Bcl-2和cleaved Caspase-3蛋白的表達，影響細胞凋亡，從而影響UC的進展。PAZMANDI等［15］研究表明，HIF是缺氧應激應答的轉錄因子，HIF-1α在炎癥性腸病（IBD）發病機制中發揮重要作用，影響先天性和適應性腸道免疫，它的普遍激活通過STAT3的活性增加RORγt的表達和FOXP3的抑制來促進Th17的極化，從而促進分泌促炎細胞因子IL-17、IFN-γ、TNF-α和TNF-β，隨后通過刺激巨噬細胞產生IL-1、IL-6、IL-8、IL-12和IL-18進而促進炎癥的發生，此外HIF-1α活化可增強糖酵解和葡萄糖攝取，促進炎癥反應［16］。WANG等［17］研究表明，FOXOs轉錄激活或抑制下游靶基因，在增殖、凋亡、自噬、代謝、炎癥、分化和抗應激等方面發揮重要作用。FOXO4的整體缺失可加劇結腸炎對炎癥刺激的反應，另外FOXO轉錄因子可介導部LPS誘導的炎性細胞因子表達，其中FOXO1通過增強成熟巨噬細胞中由TLR4介導的對LPS的信號傳導來促進炎癥。

通過構建白藜蘆醇治療UC的潛在靶點PPI網絡，發現Akt1、TNF、IL-6、TP53、STAT3和PTGS2等核心靶點。研究證實，Akt1可調節細胞增殖、分化，活化的Akt可以促進NF-κB的磷酸化，促進TNF-α等炎性因子的轉錄，造成細胞因子失衡，從而調控炎癥反應［18］。在腸黏膜中，TNF-α和IL-6的活化可促進NF-κB的活化，隨后通過正反饋調節進一步增加IL-6及TNF-α的分泌，由此發生級聯反應，不斷擴大炎癥過程［19］。p53可以通過抑制NF-κB的活化抑制體內炎癥的發生［20］；也可通過調節巨噬細胞在M1方向的極化，抑制體內廣泛的促炎基因的表達而發揮抗炎的作用，在炎癥性腸病等慢性炎癥向癌癥的轉化中發揮重要作用［21］。STAT3是IL-10下游的轉錄因子，可調節慢性腸道疾病，STAT3的激活可以刺激抗炎特性基因的表達，抑制促炎基因的表達進而發揮抗炎作用［22］。前列腺素-內過氧化物合酶2（PTGS2）是一種在炎癥反應中具有特殊作用的關鍵基因，在腸上皮細胞和單核細胞中表達，對結腸黏膜愈合過程至關重要［23］，另外PTGS2 mRNA水平升高是細胞鐵死亡的關鍵特征［24］，有助于UC的發展。

本研究體內實驗結果提示白藜蘆醇可明顯改善慢性UC小鼠體質量下降、結腸長度縮短、DAI評分升高等狀況；在病理學研究中，白藜蘆醇干預后的小鼠結腸組織病理學評分顯著降低；Western blot檢測證實白藜蘆醇干預后，小鼠結腸組織中PI3K、p-Akt/Akt蛋白表達降低，這些結果提示我們白藜蘆醇可能通過調控PI3K/Akt通路發揮治療UC的作用。

綜上所述，本研究通過網絡藥理學探討白藜蘆醇治療UC的分子機制，通過體內實驗驗證白藜蘆醇可能通過調控PI3K/Akt信號通路緩解UC，為臨床治療UC藥物的研發提供了思路和方向。本研究僅對PI3K/Akt這一信號通路進行了探索研究，未來可對網絡藥理學篩選的其他通路進一步驗證。