從lncRNA NEAT1和IRE1α/XBP1信號通路探討透骨消痛膠囊改善膝骨關節炎內質網應激研究

付長龍，梅陽陽，謝新宇，涂海水，葉錦霞，鄭春松，馬德尊*

（1.福建中醫藥大學中西醫結合研究院，福建 福州 350122；2.福建省中西醫結合老年性疾病重點實驗室，福建 福州 350122；3.福建衛生職業技術學院，福建 福州 350101）

關節軟骨退行性變是膝骨關節炎（knee osteoarthritis，KOA）的主要病理特點［1-2］。關節軟骨發生內質網應激（endoplasmic reticulum stress，ERS）可顯著加劇KOA病情［3］，其中跨膜蛋白肌醇激酶1α（IRE1α）/X盒結合蛋白1（XBP1）途徑是導致KOA關節軟骨發生ERS的關鍵環節［4-5］。有研究發現，KOA關節軟骨發生ERS與長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）的調控密切相關，尤其lncRNA NEAT1功能的發揮將影響KOA病理進程［6］。

KOA的核心病機是“本痿標痹”，因此對KOA的治則宜行補肝腎祛風濕之法［7］。透骨消痛膠囊（由巴戟天、白芍、川芎、腫節風組成）作為福建中醫藥大學附屬第二人民醫院的院內制劑，具有補腎柔肝、活血祛風的功效，臨床治療KOA療效顯著［8］。但lncRNA NEAT1與IRE1α/XBP1的調控關系在KOA的作用及透骨消痛膠囊的效用機制仍需進一步探討。

1 材 料

1.1 實驗動物與藥物 8周雄性C57BL/6小鼠（SPF級）48只，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，生產許可證號：SCXK（滬）2017-0005；實驗動物予以分籠飼養，自由飲水，標準飼料喂養飼養于福建中醫藥大學實驗動物中心，使用許可證號：SYXK（閩）2019-0007，實驗過程及方法均符合福建中醫藥大學實驗動物倫理委員會要求（倫理審批號FJTCMIACUC-2022120）。透骨消痛膠囊（閩藥制備字Z20190010000，福建中醫藥大學附屬第二人民醫院，生產批號：202205005）；?；切苋パ跄懰幔ㄒ獯罄愃沟洗笏帍S，批號：1918）。

1.2 實驗試劑 XBP1、ER伴侶蛋白78（GRP78）、C/EBP同源蛋白（CHOP）、GAPDH（美國SAB公司，批號：9N29，9N29，4612，9306）；IRE1α（武漢三鷹生物技術有限公司，批號：00101005）；Superkine超敏型ECL發光液（Abbkine生物公司，批號：ATVAP 2501）；ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix（南京諾唯贊生物科技股份有限公司，批號：027E2201 CA）；lncRNA NEAT1（Forward：GCAGGTGGCACTA CTTTGAG；Reverse：GTGACAACCATCTATTGAGCA ACT）、GAPDH（Forward：ACGGCAAGTTCAACGGCA CAG，Reverse：GAAGACGCCAGTAGACTCCACGAC）引物均由福州尚亞生物技術有限公司進行合成。

1.3 實驗儀器 微量紫外分光光度計（美國Thermo Fisher Scientific公司）；熒光定量PCR儀（美國Bio-Rad公司）；全自動酶標儀（美國BIO-TEK公司），凝膠成像系統（美國Bio-Rad公司）。

2 方 法

2.1 動物分組、造模與干預 48只小鼠適應性喂養1周后，采用隨機數字表法分為空白組12只、造模組36只。造模組動物經5%異氟醚吸入麻醉后，采用Hulth法誘導KOA模型［9］，待KOA模型建立后，再用隨機數字表法隨機分為模型組12只、對照組12只、透骨消痛膠囊組12只。對照組予以牛磺熊去氧膽酸500 mg/kg進行灌胃［10］；透骨消痛膠囊組選擇透骨消痛膠囊臨床等效劑量368 mg/kg進行灌胃［11］；空白組和模型組給予等量生理鹽水灌服，灌胃劑量依據小鼠體質量按周計算調整，4組均連續灌注胃4周。

2.2 組織取材與處理 于末次灌胃結束后，經5%異氟醚吸入麻醉后處死。收集其余小鼠膝關節軟骨組織，置于液氮中轉移至-80 ℃冰箱冷凍保存。

2.3 觀察指標

2.3.1 軟骨組織病理改變 將待測小鼠膝關節固定于小動物Micro-CT的檢查槽中，開始掃描，設置的條件為：電壓60 kV，電流666 μA，分辨率為50 μm，掃描時間為30 min，獲得不同斷面的圖片，經圖像二值化，對膝關節的掃描圖片進行三維圖像重構。

2.3.2 軟骨組織中相關蛋白表達情況 提取各組軟骨組織總蛋白，BCA進行蛋白定量，配制12%分離膠和5%濃縮膠，上樣后進行電泳，后經轉膜（半干式），封閉2 h后洗膜，再將各條膜放入預先配置好的IRE1α、XBP1、GRP78、CHOP的一抗后置于4 ℃冰箱搖床過夜進行充分震蕩反應，待二抗反應處理后，使用ECL發光液進行顯影，于凝膠成像儀下進行曝光成像，后分析儲存。

2.3.3 軟骨組織lncRNA NEAT1表達情況 按Trizol操作說明提取軟骨中總RNA，逆轉錄為cDNA，根據試劑盒進行檢測。

2.4 統計學方法 采用SPSS 26.0軟件進行數據分析。計量資料符合正態分布，數據采用（）表示，多組間比較采用方差分析，若方差齊，多組間兩兩比較采用LSD-t法；若方差不齊，多組間兩兩比較則采用Games-Howell法。P＜0.05為差異具有統計學意義。

3 結 果

3.1 實驗動物情況 本次實驗過程入組動物無出現意外死亡。

3.2 軟骨組織影像學改變情況 拍攝Micro-CT觀察膝關節的形態變化，結果顯示與空白組比較，模型組半月板結構缺失，脛骨平臺軟骨面欠光滑，呈現凹凸不平狀，并伴有明顯的骨贅增生；對照組、透骨消痛膠囊組小鼠內側半月板結構缺失，與模型組比較，其關節軟骨退變程度明顯減輕。見圖1。

圖1 膝骨關節炎模型Micro-CT鑒定結果

3.3 軟骨組織中相關蛋白表達量比較 Western blot結果顯示，與空白組比較，模型組的IRE1α、XBP1、GRP78、CHOP蛋白表達量顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，透骨消痛膠囊組與對照組的IRE1α、XBP1、GRP78、CHOP蛋白表達量顯著降低（P＜0.05）。見表1、圖2。

表1 4組軟骨組織中IRE1α、XBP1、GRP78、CHOP蛋白表達量情況（）

表1 4組軟骨組織中IRE1α、XBP1、GRP78、CHOP蛋白表達量情況（）

注：與空白組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05。

CHOP/GADPH 0.49±0.09 1.09±0.041）0.77±0.121）2）0.91±0.091）2）組別空白組模型組對照組透骨消痛膠囊組IRE1α/GADPH 0.54±0.06 1.06±0.011）0.76±0.031）2）0.83±0.021）2）XBP1/GADPH 0.49±0.01 1.21±0.011）0.83±0.071）2）0.94±0.041）2）GRP78/GADPH 0.50±0.04 1.07±0.051）0.74±0.011）2）0.87±0.011）2）

圖2 4組小鼠關節軟骨中相關蛋白條帶圖

3.4 小鼠關節軟骨組織中lncRNA NEAT1表達水平比較 qPCR結果顯示，與空白組比較，模型組關節軟骨組織中lncRNA NEAT1表達水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，透骨消痛膠囊與對照組中lncRNA NEAT1表達水平明顯降低（P＜0.05）。見表2。

表2 小鼠關節軟骨組織中lncRNA NEAT1水平比較（）

表2 小鼠關節軟骨組織中lncRNA NEAT1水平比較（）

注：與空白組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05。

lncRNA NEAT1 1.00±0.00 3.21±0.321）2.34±0.162）2.09±0.182）組別空白組模型組對照組透骨消痛膠囊組

4 討 論

研究證實，內質網應激可加劇OA軟骨退變［12］。ERS發生時，未折疊蛋白的異常堆積可促使GRP78從膜蛋白上解離，與結合未折疊蛋白結合，而IRE1α發生磷酸化后，可剪接并激活轉錄因子XBP1，XBP1的持續活化又可上調CHOP基因表達，而后者又可促使半胱天冬酶3（Caspase-3）表達，最終導致軟骨細胞凋亡［13-14］。此外，GRP78也是XBP1靶點，受XBP1激活后發揮調控ERS作用［15-16］。?；切苋パ跄懰嶙鳛橐环NERS抑制劑，本研究結果亦證實，其可抑制KOA軟骨的內質網應激，改善軟骨退變程度。

lncRNA NEAT1作為一種與KOA發生、發展密切相關的非編碼長鏈RNA，在調控軟骨細胞內質網應激方面充當了重要的角色［17］。研究表明，在KOA軟骨和軟骨細胞中，lncRNA NEAT1含量表達顯著增高［18］；有研究證實，過表達lncRNA NEAT1可顯著上調與內質網應激密切相關蛋白的XBP-1S/XBP-1U比值與GRP78表達［19］。而NEAT1下調可抑制內質網應激調控的細胞凋亡［20］。本研究結果顯示，在KOA模型小鼠軟骨組織中，lncRNA NEAT1基因水平較空白組顯著升高，IRE1α、XBP1、GRP78、CHOP蛋白含量顯著升高，而經透骨消痛膠囊干預后，小鼠軟骨組織中上述指標表達呈顯著下降趨勢，進而可以有效延緩KOA小鼠軟骨退變，這亦與本研究Micro-CT結果相一致。

綜上，本研究結果表明，透骨消痛膠囊可以有效延緩KOA小鼠軟骨退變，其機制與下調KOA小鼠軟骨組織中lncRNA NEAT1水平及IRE1α/XBP1信號通路相關蛋白含量表達，進而緩解ERS密切有關。同時，本研究仍存在一定的局限性，即透骨消痛膠囊與lncRNA NEAT1和IRE1α/XBP1的內在靶向調控機制尚需進一步探討。