紫白膏對(duì)大鼠肛周創(chuàng)面愈合及皮膚組織IL-1β、TNF-α表達(dá)的影響

李陽(yáng)，汪昭楚，王菁，黃鴻鈴，趙晨孜，劉純香，石榮*

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院，福建 福州 350004；2.陳民藩國(guó)醫(yī)大師傳承工作室，福建 福州 350004）

由于肛門特殊的生理功能和解剖位置，肛腸手術(shù)多采用開(kāi)放性創(chuàng)面，術(shù)后愈合時(shí)間較長(zhǎng)；加之排便刺激及腸道菌群的影響，術(shù)后創(chuàng)面易出現(xiàn)感染、水腫、滲出增多等情況，從而增加患者的痛苦和住院時(shí)間。紫白膏是國(guó)醫(yī)大師陳民藩教授創(chuàng)立的肛腸科制劑，團(tuán)隊(duì)前期研究表明紫白膏可下調(diào)NF-κB mRNA、1L-6的表達(dá)，有效促進(jìn)創(chuàng)面愈合［1-3］。本研究采用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，通過(guò)模擬大鼠肛周術(shù)后皮膚創(chuàng)面模型，觀察大鼠背部皮膚創(chuàng)面組織在紫白膏作用下，其白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）水平的變化，探討紫白膏在創(chuàng)面愈合過(guò)程的作用機(jī)制。

1 材 料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)雄性SD大鼠90只，8周齡，體質(zhì)量（250±25 g），由杭州醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供，生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（浙）2019-0002，大鼠于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室檢疫間適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，使用許可證號(hào)為SYXK（閩）2022-0002。本實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照動(dòng)物實(shí)驗(yàn)規(guī)范進(jìn)行（動(dòng)物倫理批號(hào)：FJABR2022052001）。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物與主要試劑 紫白膏（福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院院內(nèi)制劑，由大黃、紫草、白及、煅石膏、冰片組成，批號(hào)：220209）；0.9%氯化鈉注射液（福州海王福藥制藥公司，批號(hào)：200218A24）；75%乙醇消毒液（山東利爾康公司，批號(hào)：210901）；水合氯醛（上海阿拉丁生化科技公司，批號(hào)：K913111）；醫(yī)用紗布?jí)K（南昌意爾康公司，批號(hào)：20220316）；大青葉抑菌液（河南杰東藥業(yè)公司，批號(hào)：19061301）；莫匹羅星軟膏（中美史克公司，批號(hào)：PD38）；凡士林（浙江振德醫(yī)療公司，批號(hào)：202210231A），混合痔患者術(shù)后新鮮糞便。大鼠IL-1β ELISA檢測(cè)試劑盒（江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司，批號(hào)：MM-0047R1）、大鼠TNF-α ELISA檢測(cè)試劑盒（江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司，批號(hào)：MM-0181R1）。

1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器 酶標(biāo)儀、化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（美國(guó)伯樂(lè)公司）。

2 方 法

2.1 實(shí)驗(yàn)方法

2.1.1 肛周創(chuàng)面造模及評(píng)價(jià) 參照文獻(xiàn)［3］對(duì)大鼠進(jìn)行肛周創(chuàng)面造模。選用腹腔注射麻醉，每只大鼠使用3.5 mL/kg的10%水合氯醛。局部備皮，常規(guī)消毒后，以大鼠背部為圓心，直徑約為2 cm，做一圓形切口，以先皮膚全層，后皮下淺筋膜直至肌層的順序剪開(kāi)，創(chuàng)面充分止血后以油紗、敷料、膠帶固定。空白組每次換藥前不滴加糞液，僅用生理鹽水紗條濕敷。其余各干預(yù)組每次換藥前0.5 h均在創(chuàng)面上滴加糞液1 mL（混合痔患者術(shù)后的新鮮糞便10 g，加生理鹽水5 mL，混勻，離心，取上清液，現(xiàn)配現(xiàn)用），大鼠創(chuàng)面見(jiàn)紅腫隆起，超過(guò)創(chuàng)緣水平面，并伴有炎癥滲出即為造模成功。

2.1.2 動(dòng)物分組及給藥 90只清潔級(jí)SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組、模型組、凡士林組、紫白膏組、大青葉組和莫匹羅星軟膏組，每組15只。除空白組外，各組大鼠均予模擬肛周術(shù)后皮膚創(chuàng)面造模。創(chuàng)面常規(guī)清創(chuàng)后，空白組、模型組均予生理鹽水紗條濕敷，凡士林組、紫白膏組、大青葉組及莫匹羅星軟膏組分別予對(duì)應(yīng)藥物干預(yù)，使用棉簽蘸取少量藥物完整、均勻地涂覆創(chuàng)面，層厚約1 mm。各組干預(yù)后予清潔敷料覆蓋，外用膠布固定。每日以相同的方法換藥1次。

2.1.3 創(chuàng)面組織標(biāo)本采集 各組分別于治療后第3、7、14 d腹腔注射10%水合氯醛進(jìn)行麻醉，以背部皮膚創(chuàng)面為中心沿創(chuàng)緣剪取組織標(biāo)本，分類標(biāo)記后于-80 ℃環(huán)境凍存，備EILSA檢測(cè)。

2.2 大鼠創(chuàng)面愈合情況觀察 觀察治療后第3、7、14 d創(chuàng)面愈合率及創(chuàng)面愈合面積。采用心電圖網(wǎng)格紙（1小格1 mm）測(cè)量創(chuàng)面面積大小，并計(jì)算創(chuàng)面愈合率。創(chuàng)面愈合率的計(jì)算公式如下：

創(chuàng)面愈合率＝（原創(chuàng)面面積－現(xiàn)創(chuàng)面面積）/原創(chuàng)面面積×100%

2.3 大鼠創(chuàng)面組織的IL-1β、TNF-α含量測(cè)定 采用ELISA法分別檢測(cè)大鼠肛周模型創(chuàng)面組織的IL-1β、TNF-α含量，大致步驟如下：沖洗、剪碎及研磨組織后得到5 000 g勻漿液，予離心后取上清液備檢測(cè)。標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50 μL；樣本孔中加入待測(cè)樣本50 μL；空白孔不加。標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中加入辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測(cè)抗體100 μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，恒溫箱溫育60 min。棄液，重復(fù)洗板5次。加入反應(yīng)底物A、B，37 ℃避光孵育15 min。加入終止液50 μL，15 min內(nèi)于450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料符合正態(tài)分布采用（）描述，創(chuàng)面愈合率比較采用單因素方差分析，組間比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)。P＜0.05則為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 大鼠創(chuàng)面愈合結(jié)果 5組大鼠創(chuàng)面外觀愈合情況，見(jiàn)圖1。5組大鼠創(chuàng)面愈合率隨著治療天數(shù)的增加而改善。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與模型組相比，治療后第3、7 d各組之間創(chuàng)面愈合率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。治療后第14 d，莫匹羅星軟膏組與模型組創(chuàng)面愈合率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；凡士林組、紫白膏組、大青葉組的創(chuàng)面愈合率與模型組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1、圖2。

表1 5組大鼠創(chuàng)面面積不同時(shí)間點(diǎn)比較（）mm2

表1 5組大鼠創(chuàng)面面積不同時(shí)間點(diǎn)比較（）mm2

注：與模型同時(shí)間點(diǎn)組比較，1） P＜0.05。

治療第14天54.60±5.18 48.68±6.261）43.04±5.571）46.74±8.451）52.50±11.51模型組凡士林組紫白膏組大青葉組莫匹羅星軟膏組15 15 15 15 15 314.56±3.35 312.46±4.70 313.45±3.24 309.73±4.35 313.53±3.07 270.66±11.88 269.97±14.34 267.75±12.36 264.54±15.66 268.84±5.43 198.36±11.41 202.39±12.64 201.32±4.96 193.45±14.29 197.39±15.07組別n 原始面積治療第3天治療第7天

圖1 5組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)創(chuàng)面外觀比較

圖2 5組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)創(chuàng)面愈合率比較

3.2 6組大鼠創(chuàng)面組織治療不同時(shí)間點(diǎn)IL-1β、TNF-α含量比較 見(jiàn)表2～表3。

表2 6組大鼠治療不同時(shí)間點(diǎn)創(chuàng)面組織IL-1β含量比較（） pg/mL

表2 6組大鼠治療不同時(shí)間點(diǎn)創(chuàng)面組織IL-1β含量比較（） pg/mL

注：與空白組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05；與紫白膏組比較，3） P＜0.05。

第14天16.52±0.37 20.13±0.411）20.00±0.633）17.11±0.552）19.04±0.813）18.95±0.682）3）組別空白組模型組凡士林組紫白膏組大青葉組莫匹羅星軟膏組n 15 15 15 15 15 15第3天16.22±0.92 21.33±1.221）21.08±0.65 19.77±1.10 20.68±0.76 20.15±0.83第7天16.93±0.55 20.94±1.301）20.26±0.87 18.85±0.812）20.11±0.89 19.72±1.06

表3 6組大鼠治療不同時(shí)間點(diǎn)創(chuàng)面組織TNF-α含量比較（） pg/mL

表3 6組大鼠治療不同時(shí)間點(diǎn)創(chuàng)面組織TNF-α含量比較（） pg/mL

注：與空白組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05；與凡士林組比較，3） P＜0.05。

第14天79.62±2.00 93.17±2.831）89.02±0.95 80.60±2.642）3）84.88±2.132）85.85±5.592）組別空白組模型組凡士林組紫白膏組大青葉組莫匹羅星軟膏組n 15 15 15 15 15 15第3天77.48±3.56 90.10±1.311）92.55±3.35 87.99±2.70 88.42±2.96 88.61±3.26第7天78.57±2.89 93.59±4.211）90.52±3.93 83.44±2.642）87.37±2.932）87.78±1.77

4 討 論

創(chuàng)面愈合是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，從凝血開(kāi)始，經(jīng)壞死組織、異物和細(xì)菌的清除等一系列過(guò)程，以新生組織形成并填補(bǔ)傷口缺損結(jié)束，包括止血、消炎、生長(zhǎng)、再上皮化和重構(gòu)等不同階段，其中涉及多種細(xì)胞和炎性因子的參與［4-5］。LV等［6］研究發(fā)現(xiàn)，六合丹在兔創(chuàng)面愈合過(guò)程中，特異性地抑制IL-1β的表達(dá)，減少感染傷口炎癥因子的釋放，可促進(jìn)感染傷口的愈合。TNF-α也是參與炎癥反應(yīng)的一個(gè)重要細(xì)胞因子，在創(chuàng)面分泌物中TNF-α水平持續(xù)增高，高滲應(yīng)激致細(xì)胞凋亡和壞死，細(xì)胞周期持續(xù)阻滯，促使創(chuàng)面發(fā)生炎癥反應(yīng)，延緩創(chuàng)面愈合［7］。姚昶等［8］研究也表明瘡靈液載入膠原對(duì)慢性創(chuàng)面的促愈作用與TNF-α水平的下調(diào)有關(guān)。

中醫(yī)外治法在促進(jìn)創(chuàng)面治療方面具有作用直接、療效好、成本低、患者易接受等優(yōu)點(diǎn)。紫白膏是國(guó)醫(yī)大師陳民藩教授運(yùn)用“酸澀收斂”理論研制的中藥復(fù)方制劑，在臨床中廣泛應(yīng)用于治療痔、瘺、裂等肛腸疾病以及術(shù)后的治療［9-10］。紫白膏以大黃、紫草為君，白及、煅石膏為臣，佐以冰片，其中大黃清熱瀉火兼以除濕祛瘀，紫草清熱解毒涼血，治療熱邪迫血溢于脈外，起祛陳化新、消腫止痛之效；石膏瀉火，熱去則血寧，輔助止血的同時(shí)又可斂瘡生肌，與白及同用能收能止，使瘡可斂、血得安，助君藥清熱瀉火生肌，加速傷口愈合；冰片能消結(jié)散腫，增強(qiáng)清熱瀉火之效。諸藥合用，既能清熱解毒，消腫止痛，又能涼血止血，促進(jìn)創(chuàng)面愈合。

創(chuàng)面造模后受糞便菌群的影響，易加重炎癥反應(yīng)，影響創(chuàng)面愈合。大青葉抑菌液為中藥提取物的復(fù)方制劑，主要針對(duì)金黃色葡萄球菌等革蘭氏陽(yáng)性菌譜，是體外抑菌的常用藥物［11］，而莫匹羅星軟膏對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌有更強(qiáng)的活性［12］。研究表明，肛周疾病的菌群分布既有革蘭氏陰性菌又有革蘭氏陽(yáng)性菌［13］，故本研究設(shè)置肛腸科常用的大青葉抑菌液、莫匹羅星軟膏和紫白膏作為主要干預(yù)藥物，對(duì)比不同抑菌條件下的療效差異。

本研究結(jié)果表明，在治療第14天，紫白膏組、大青葉組、凡士林組的創(chuàng)面愈合率明顯高于模型組（P＜0.05），凡士林組的促進(jìn)愈合作用很可能是凡士林對(duì)創(chuàng)面的保護(hù)作用，減少了創(chuàng)面的受污染程度；莫匹羅星軟膏促進(jìn)愈合作用相對(duì)不明顯，可能與其特殊的陽(yáng)性抗菌譜有關(guān)。ELISA實(shí)驗(yàn)表明，大鼠造模后IL-1β及TNF-α的含量均明顯升高（P＜0.05），證明肛腸疾病術(shù)后，肛周環(huán)境更利于細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖，從而引起更為嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)。治療第7天，與模型組比較，紫白膏組大鼠創(chuàng)面組織IL-1β含量明顯下降，紫白膏組、大青葉組大鼠創(chuàng)面組織TNF-α含量明顯下降（P＜0.05）。治療第14天，與模型組比較，紫白膏組大鼠創(chuàng)面組織的IL-1β含量明顯下降（P＜0.05），紫白膏組、大青葉組、莫匹羅星軟膏組大鼠創(chuàng)面組織的TNF-α含量明顯下降（P＜0.05）。以上結(jié)果表明，大青葉的促愈機(jī)制可能與抑菌作用下TNF-α的明顯下調(diào)有關(guān)，而紫白膏對(duì)IL-1β與TNF-α均有明顯的調(diào)控作用，且這2種炎性因子含量更低。

綜上所述，紫白膏能明顯促進(jìn)大鼠創(chuàng)面愈合，減少創(chuàng)面組織IL-1β和TNF-α的水平，減輕創(chuàng)面炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。在今后的研究中，需要進(jìn)一步明確紫白膏對(duì)肛周創(chuàng)面的抗炎、抑菌及促生長(zhǎng)效應(yīng)，以擴(kuò)大其臨床應(yīng)用。