Wnt3a基因多態性與崇仁麻雞皮膚毛囊性狀相關性研究
2023-07-31 08:57:02康昭風黎觀紅武艷平謝金防
畜牧獸醫學報 2023年7期
陳 春,康昭風,魏 岳,黎觀紅,武艷平*,謝金防*
(1.江西省農業科學院畜牧獸醫研究所,南昌 330200;2.江西農業大學動物科學技術學院,南昌 330095)
2013年我國發生了H7N9禽流感,該病毒會致家禽死亡,隨著研發疫苗的投入使用,禽流感病毒才慢慢得到控制[1]。屠宰冷藏后的冰鮮雞成為一種銷售趨勢,冰鮮雞因其“規模養殖、集中屠宰、冷鏈配送、生鮮上市”的安全健康的生產售賣方式得到了廣大消費者的喜愛[2]。消費者從之前購買活雞時看羽毛色澤轉向了購買冰鮮雞時看胴體包裝性狀。皮膚緊湊不松散,膚色鮮嫩,毛孔細而密的冰鮮雞更容易引起消費者的購買欲[3]。近年來的研究多集中于雞皮膚嫩度、皮膚色澤方面,但在雞胴體性狀,如皮膚毛孔等方面的研究比較少,因此冰鮮雞良好的胴體包裝性狀還需投入更多的研究。
毛囊生成毛孔,毛囊是皮膚一個復雜的微型器官,由真皮細胞和上皮細胞信號分子互相作用發育而來[4]。皮膚毛囊的形成在個體的一生中只發生一次,并且形成于胚胎期,其數量在這時已經固定,之后通常不會再增加[5]。研究表明,雞皮膚毛囊分為兩種類型,初級毛囊(primary hair follicle,PF)和次級毛囊(secondary hair follicle,SF)[6]。黃羽肉雞在胚胎期E7-E9的表皮基板出現在真皮凝結的上方,皮膚出現突起,在E10-E11開始出現前后端伸長不對稱的羽芽,在E12時表皮內陷形成PF,到E15時,PF密度達到最大,并且出現SF,SF密度開始增大[7]。研究表明,PF和SF互不干擾獨立生長[8]。然而,在某些特殊的情況下,毛囊再增加或減少的情況是有可能的。在成熟鹿再次新生的鹿角上,新生的皮膚會長出新的毛囊[9]。毛囊發育會經歷3個階段的周期性循環,即快速增長的生長期、細胞凋亡驅動的退化期以及相對靜止期[10-11]。毛囊的形態發生涉及到多條通路,依賴于Wnt(wnt signaling pathway)信號通路、β-連環蛋白(β-catenin)、SHH信號通路(sonic hedgehog signaling pathway)、NOTCH信號通路(notch signaling pathway)和骨形態發生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)等,這些通路的信號分子在上皮細胞和真皮細胞之間相互作用[12-13]。Wnt3a是Wnt家族具有代表性的一種分泌蛋白,位于雞的2號染色體上,主要通過促進β-catenin的積累,激活經典的Wnt/β-catenin信號通路,從而誘導皮膚毛囊的生長發育[14]。研究發現,Wnt3a基因還可以通過激活Wnt/β-catenin信號通路促進皮膚黑色素形成[15]。Wnt3a基因缺失會使神經嵴細胞凋亡,導致皮膚生成黑色素的功能喪失[16]。單核苷酸多態性(single nucleotide poly-morphism,SNP)是在基因組上由單個核苷酸變異引起的DNA序列多態性,是DNA分子標記技術的一種[17]。研究發現,Wnt3a基因的SNPs位點與花山麻雞皮膚毛囊密度具有相關性,表明Wnt3a基因是誘導雞皮膚毛囊發育的關鍵調控因子,是影響雞皮膚毛囊生長發育的重要候選基因[18]。目前,分子標記技術在家禽優質胴體如雞膚色和屠宰性能等研究中應用較廣泛。研究發現,醛脫氫酶1家族成員 A3(aldehyde dehydrogenase family 1 member A3,ALDH1A3)基因SNP位點與雞膚色具有顯著相關性,g.703 T>C位點CC基因型個體屠宰后肩部皮膚黃度大于CT和TT基因型個體,表明ALDH1A3基因可以作為雞膚色性狀的候選基因,有分子育種的潛能[19]。對商品化松雞品系的G0S2(G0/G1 switch gene 2)基因進行克隆和測序,研究發現雞G0S2基因的g.102 G>A位點AA和AG基因型個體的活重和腹脂重均高于GG基因型個體,該位點與雞活重和腹脂重顯著相關[20]。研究還發現,前黑素濃縮激素 (pro melanin concentrating hormone,PMCH)基因中有7個SNPs,其中c.81 A>T位點與雞腿部剪切力和胸部剪切力顯著相關[21]。雞皮膚毛孔作為冰鮮雞胴體性狀的評價指標之一具有重要的經濟價值。皮膚毛孔數量變異度為52.35,遺傳力為0.723,具有高遺傳力,表明環境對皮膚毛孔數量性狀影響較小[22]。Wnt3a基因是調控雞皮膚毛囊生長發育的重要因子,基于DNA分子標記技術能夠發現Wnt3a基因中某個核苷酸的變異,有助于了解它的遺傳變異能力,可以通過基因分型來篩選優質毛囊密度性狀個體進而進行輔助選擇育種。那么Wnt3a基因多態性與崇仁麻雞的皮膚毛囊密度性狀是否具有相關性?篩選檢測到的SNPs位點在崇仁麻雞皮膚毛囊性狀中究竟有著怎樣的影響?因此,本試驗以崇仁麻雞為研究對象,探究雞皮膚毛囊密度性狀與Wnt3a基因多態位點的相關性,篩選出能提高皮膚毛囊密度的分子標記,為之后進一步進行雞皮膚毛囊分子育種研究提供理論參考。
1 材料與方法
1.1 試驗動物及樣品采集
試驗動物崇仁麻雞來自江西省撫州市崇仁縣崇仁麻雞原種場的原種和B系,B系是原種和快大白羽肉雞雜交后再橫交固定。隨機選取體重相近且健康的崇仁麻雞原種母雞200只和公雞100只以及B系母雞200只和公雞100只。每只雞右腳戴上腳號并記錄,用加了抗凝劑的采血管在雞翅靜脈采血1 mL寫上編號后放于-20 ℃冰箱中冷凍保存,用于DNA的提取。屠宰拔毛后,在每只雞的背部、胸部、大腿部相同的位置2 cm×2 cm面積內測量皮膚毛囊密度并采集兩份皮膚毛囊樣品,一份樣品裝入中性多聚甲醛固定液中常溫避光保存,用于制作毛囊切片,測量毛囊直徑和皮膚厚度,另一份樣品裝入凍存管迅速置于液氮速凍,并放入-80 ℃冰箱保存,用于RNA的提取。
1.2 主要試劑和儀器
血液基因組柱式小量提取試劑盒(CW2087M)、2xEs Taq MasterMix(CW0690H)、超純RNA提取試劑盒(CW0581M)均購自江蘇康為世紀生物科技股份有限公司,FastKing cDNA第一鏈合成試劑盒(KR116)、SuperReal 熒光定量預混試劑增強版(SYBR Green)(FP205)均購自北京天根生化科技有限公司。高速冷凍離心機(Neofuge 15R)、基因擴增儀(MGL96G)、三用恒溫水箱(HH-W600)、電泳儀電源(DYY-4C)、羅氏LightCycler96實時熒光定量PCR儀、多樣品組織研磨儀(TissueLyser-24)等。
1.3 毛囊性狀的測定
毛囊密度的測定:在每只雞背部、胸部和大腿部皮膚相同位置2 cm×2 cm面積內數毛孔個數并計算密度(個·cm-2)。
毛囊直徑和皮膚厚度的測定:將樣品送往江西愛思博生物科技服務有限公司制作HE染色切片,并用電子顯微鏡觀察切片,測量皮膚厚度(μm)和毛囊直徑(μm),每個樣本測3個毛囊取平均值。
1.4 引物的設計與合成
如表1所示,引物根據NCBI數據庫中Wnt3a基因序列(登錄號:NC_052533)來設計,根據相關研究[18]與皮膚毛囊性狀相關的位點設計3對引物,分別來自于第二外顯子、第三外顯子和第三內含子。如表2所示,根據NCBI數據庫中Wnt3a和內參β-actin相關mRNA序列設計實時熒光定量引物。均由上海生工生物工程股份有限公司對引物進行合成。
表1 Wnt3a基因SNP位點引物序列Table 1 The primer sequences for SNP loci of Wnt3a gene
表2 Wnt3a基因實時熒光定量引物Table 2 The real-time fluorescent quantitative primers for Wnt3a gene
1.5 DNA的提取和PCR擴增
按照血液基因組柱式小量提取試劑盒步驟提取DNA,用電泳和紫外分光光度計檢測其純度和濃度,以質檢合格的DNA為模板進行PCR擴增。PCR反應體系為20 μL:2×Es Taq MasterMix 10 μL,上游引物1 μL,下游引物1 μL,DNA模板1 μL,雙蒸水7 μL。反應程序為:預變性94 ℃持續2 min;變性94 ℃持續30 s,退火60 ℃持續30 s,延伸72 ℃ 持續30 s,35個循環;終延伸72 ℃持續2 min。擴增后的PCR產物以2%濃度的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測,120 V,80 mA,15 min跑膠,再送至上海生工生物工程股份有限公司進行基因測序。測序后先用BioEdit(7.0.5.3)軟件進行序列比對,再用Chromas(2.6.5)軟件查看峰圖對突變位點進行篩選。
1.6 總RNA的提取和實時熒光定量PCR
按照超純RNA提取試劑盒步驟提取RNA,對提取的總RNA進行2%的凝膠電泳檢測,再用紫外分光光度計對純度和濃度進行檢測,質檢合格的總RNA按照反轉錄試劑盒合成第一鏈cDNA。按照SYBR Green 1試劑進行Real Time PCR,優化熒光實時定量PCR的反應條件,確定反應體系為20 μL:2×SuperReal PreMix Plus 10 μL,正向引物0.6 μL,反向引物0.6 μL,cDNA模板1 μL,RNase-free ddH2O 7.8 μL。每個樣本和內參都設置3個重復。采用兩步法PCR反應程序進行反應:預變性95 ℃持續15 min,循環1次;PCR反應時變性95 ℃持續10 s,退火/延伸60 ℃持續30 s,循環40次;之后是熔解曲線95 ℃持續10 s,65 ℃持續60 s,97 ℃持續1 s。
1.7 統計分析
試驗數據采用SPSS22.0軟件獨立樣本t檢驗進行顯著性分析,以“平均值±標準差”表示,P<0.05表示差異顯著,P<0.01表示差異極顯著,P>0.05表示差異不顯著。
找到SNPs位點后,統計各位點的基因型、基因型頻率、等位基因頻率、雜合度(He)、有效等位基因數(Ne)和多態信息含量(PIC)。再采用SPSS22.0軟件進行卡方檢驗(X2)來驗證Hardy-Weinberg遺傳平衡。采用廣義線性模型對毛囊密度和基因相關位點進行分析,數學模型為:Yij=μ+Gi+eij,其中Yij為性狀觀測值,μ為總體均數,Gi為基因型效應,eij為隨機誤差,不同基因型性狀間的差異用Duncan法進行多重比較,最終以“平均數±標準差”表示。
實時熒光定量PCR采用公式2-ΔΔct計算原種和B系Wnt3a基因的mRNA相對表達量,用SPSS22.0軟件進行獨立樣本t檢驗分析,最后結果用GraphPad 5.0繪圖表示。
2 結 果
2.1 崇仁麻雞皮膚毛囊形態結構及性狀的測定
2.1.1 毛囊的類型和結構 如圖1所示,雞皮膚毛囊分為初級毛囊(PF)和次級毛囊(SF)兩種類型。初級毛囊較次級毛囊發育早,且兩種類型的毛囊生長發育互不干擾,獨立存在[23]。毛囊由外到內主要的結構是:結締組織鞘、毛囊壁、外根鞘、內根鞘、真皮乳頭和羽枝嵴。羽枝嵴最后會形成脊柱,即羽毛的主干部分[24]。
A.毛囊結構(橫切100×):ORS. 外根鞘;IRS. 內根鞘;SR. 羽軸嵴;BB. 羽小枝;Dp. 真皮髓;FW. 毛囊壁;CTS. 結締組織鞘。B.毛囊結構(縱切100×):HB. 毛球;DP. 真皮乳頭;SG. 皮脂腺。C.毛囊類型(橫切20×):PF. 初級毛囊;SF. 次級毛囊。D.初級毛囊(橫切40×)A. Hair follicle structure (cross cut 100×): ORS. Outer root sheath; IRS. Internal root sheath; SR. Scapus ridge; BB. Barbules; Dp. Dermal pulp; FW. Follicle wall; CTS. Connective tissue sheath. B. Hair follicle structure (longitudinal cut 100×): HB. Hair bulb; DP. Dermal papillae; SG. Sebaceous gland. C. Hair follicle type (cross cut 20×): PF. Primary hair follicle; SF. Secondary hair follicles. D. Primary hair follicles (cross cut 40×)圖1 雞毛囊HE染色Fig.1 HE staining of chicken hair follicles
2.1.2 毛囊密度、直徑和皮膚厚度的測定 在崇仁麻雞原種和B系中,分別在背部、胸部和大腿部各部位相同位置測量毛囊密度、毛囊直徑和皮膚厚度。結果見表3。
表3 雞皮膚毛囊性狀測定Table 3 Determination of skin hair follicle traits in chicken
2.2 Wnt3a基因的多態性及遺傳效應
2.2.1Wnt3a基因SNP位點的篩選 在崇仁麻雞原種和B系公、母雞中均發現了3個突變位點及多種基因型。如圖2所示,在第2外顯子發現了1個SNP位點g.2587569,發生G>A突變,只有兩種基因型GG和AG。如圖3所示,在第3外顯子發現了1個SNP位點g.2555812,發生T>C突變,有3種基因型CC、TT、CT。如圖4所示,在第3內含子上發現了1個SNP位點g.2555377,發生T>C突變,有3種基因型CC、TT、CT。
圖2 雞Wnt3a基因第2外顯子不同基因型測序峰圖Fig.2 Sequencing peak of different genotypes in exon 2 of chicken Wnt3a gene
圖3 雞Wnt3a基因第3外顯子不同基因型測序峰圖Fig.3 Sequencing peak of different genotypes in exon 3 of chicken Wnt3a gene
圖4 雞Wnt3a基因第3內含子不同基因型測序峰圖Fig.4 Sequencing peak of different genotypes in intron 3 of chicken Wnt3a gene
2.2.2 哈迪-溫伯格平衡檢驗 用卡方檢驗法來驗證Hardy-Weinberg平衡檢驗是否符合遺傳定律。如表4所示,崇仁麻雞原種和B系的公、母雞Wnt3a基因3個SNPs位點基因型分布的實際觀測值和理論觀測值都無顯著差異(P>0.05),因此符合遺傳定律,可以進行下一步分析。
表4 Wnt3a基因SNP位點的Hardy-Weinberg平衡檢驗Table 4 Hardy-Weinberg equilibrium test for SNP loci of Wnt3a gene
2.2.3Wnt3a基因各SNP位點遺傳參數 如表5所示,在原種中,Wnt3a基因的g.2587569 G>A位點GG是優勢基因型,G為優勢等位基因;g.2555812 T>C位點CC是優勢基因型,C為優勢等位基因;g.2555377 T>C位點CT是優勢基因型,C為優勢等位基因。g.2587569 G>A位點是低度多態,PIC<0.25;g.2555812 T>C位點是中度多態位點,0.25
表5 原種Wnt3a基因SNP位點遺傳參數Table 5 Genetic parameters of SNP loci of protospecies Wnt3a gene
表6 B系Wnt3a基因各SNP位點遺傳參數Table 6 Genetic parameters of each SNP loci of B strain Wnt3a gene
2.2.4Wnt3a基因SNP位點和崇仁麻雞皮膚毛囊密度相關性 如表7所示,在原種母雞中,g.2555812 T>C和g.2555377 T>C位點CC基因型個體背部皮膚毛囊密度顯著高于CT基因型個體(P<0.05)。在公雞中,g.2555812 T>C位點CC基因型個體背部毛囊密度顯著高于其他兩種基因型個體(P<0.05),g.2555377 T>C位點CC基因型個體背部毛囊密度顯著高于CT基因型個體(P<0.05)。如表8所示,在B系中,g.2555812 T>C位點在母雞和公雞的CC基因型個體背部毛囊密度顯著高于其他兩種基因型個體(P<0.05),g.2555377 T>C位點在母雞中CC基因型個體背部毛囊密度顯著高于CT基因型個體(P<0.05),在公雞中CC基因型個體背部毛囊密度顯著高于其他兩個基因型個體(P<0.05)。
表7 Wnt3a基因SNPs位點基因型與原種雞各部位皮膚毛囊密度相關性分析Table 7 Correlation analysis of Wnt3a gene SNPs loci genotypes with skin hair follicle density in different parts of protospecies 個·cm-2
表8 Wnt3a基因SNP位點基因型與B系雞各部位皮膚毛囊密度相關性分析Table 8 Correlation analysis of Wnt3a SNP loci genotypes with skin hair follicle density in various parts of B strain 個·cm-2
2.3 Wnt3a在雞各部位皮膚組織中的mRNA表達量
如圖5所示,Wnt3a基因在崇仁麻雞原種和B系的背部、胸部和大腿部皮膚中均有表達,且表達量比較高。同性別相比較,Wnt3a基因在原種背部皮膚毛囊中的表達量顯著高于在B系背部皮膚毛囊中的表達量(P<0.05)。Wnt3a基因在原種和B系公、母雞的胸部和大腿部表達量無顯著差異(P>0.05)。
*表示差異顯著(P<0.05)* indicates significant difference(P<0.05)圖5 Wnt3a基因在雞各部位皮膚毛囊組織中的相對表達量Fig.5 Relative expression of Wnt3a gene in chicken skin hair follicles
3 討 論
3.1 雞皮膚毛囊性狀測定分析
不同品種和不同性別的雞皮膚毛孔性狀在不同日齡和不同皮膚部位都有比較大的差異。在本研究中,原種和B系同性別同皮膚部位相比較,原種母雞背部毛囊密度極顯著高于B系(P<0.01),大腿部毛囊密度顯著高于B系(P<0.05),背部和大腿部毛囊直徑顯著低于B系(P<0.05)。原種公雞背部毛囊密度極顯著高于B系(P<0.01),胸部毛囊密度極顯著低于B系(P<0.01),背部和大腿部毛囊直徑顯著低于B系(P<0.05)。原種公雞胸部皮膚厚度顯著低于B系(P<0.05),原種公、母雞大腿部皮膚厚度均顯著低于B系(P<0.05)。研究結果得出,原種和B系相比較,原種公、母雞背部和大腿部皮膚毛囊密度大且直徑小,B系恰好相反皮膚毛囊密度小且直徑大,表明相較于B系,原種皮膚毛囊更加細密。前人研究發現,茶花雞大腿部和背部的毛囊密度高于狼山雞大腿部和背部,而毛囊直徑低于狼山雞,表明茶花雞大腿部和背部的皮膚毛囊相較于狼山雞更加細密[25]。研究表明,不同類型的雞毛囊密度和直徑差異顯著與調控毛囊基因的通路表達有關,Wnt信號通路在毛囊誘導過程中起關鍵作用,是毛囊再生的關鍵調控因子[26-27]。經典的Wnt/β-catenin通路參與了毛囊羽芽、倒鉤嵴和邊緣板等結構的形成[28]。Wnt家族成員眾多,至少由19種分泌蛋白組成[29]。Wnt3a和Wnt7a基因可作為誘導信號,誘導小鼠真皮乳頭保持生長初期狀態[30]。Wnt10b基因幾乎只局限于在表皮基板中表達。Wnt5a基因誘導真皮凝結物和真皮乳頭的形成[31]。在鵝毛囊發育研究中發現,Wnt5a基因抑制毛囊的發育,呈現負向調控[32]。隨后在小鼠毛發上經研究證實Wnt5a基因抑制毛囊從休止期到生長期的轉變[33]。研究表明,Wnt7b基因是毛囊干細胞穩態和毛囊周期性循環的重要調節因子[34]。除了Wnt信號通路外,還有SHH通路是真皮乳頭發育成熟的關鍵調控因子,Notch信號通路決定干細胞命運,而BMP通路作為強有力的抑制劑,抑制毛囊的生長發育[35-37]。原種和B系各皮膚部位的皮膚厚度有差異,根據相關研究表明可能與耐熱性不同有關[38-39],B系更加活潑好動,在高溫天氣為了平衡散熱毛孔相較于原種更加粗大,B系體型更大,腿部脂肪沉積多于原種。
3.2 Wnt3a基因遺傳效應及多態性分析
卡方(χ2)檢驗表明,Wnt3a基因序列篩選發現的3個SNPs位點基因型分布的實際觀測值和理論觀測值差異不顯著(P>0.05),符合遺傳平衡定律,說明試驗選擇的樣本群體基數夠大、隨機性較強。Wnt3a基因的遺傳多態性分析發現,在原種中g.2555812 T>C位點呈現中度多態,0.25
3.3 雞Wnt3a基因多態性在皮膚毛囊分子育種上的應用
皮膚毛孔作為冰鮮雞胴體外觀性狀評價指標之一,毛孔分布的均勻度、密集程度和粗細都會影響雞胴體表觀質量。上市日齡的雞胴體背部、胸部和大腿部是被注意到最直觀的部位,若這3個部位的毛孔粗大又疏散很難引起消費者的購買欲,可能會被認為是不新鮮、不優質的冰鮮雞。SNP遺傳穩定性高、數量多分布范圍廣以及檢測的準確性高,在畜禽分子標記篩選中被大量應用[45]。本研究以崇仁麻雞為試驗對象,在Wnt3a基因上發現篩選到的g.2555812 T>C和g.2555377 T>C位點與雞背部皮膚毛囊密度有顯著相關性,均有3種基因型CC、TT和CT。在原種和B系中均是CC基因型個體背部毛囊密度高于其他兩種基因型個體。根據這個研究結果,可以利用SNP分子標記技術快速便捷的篩選優質皮膚毛囊性狀雞胴體。比起傳統遺傳育種,崇仁麻雞Wnt3a基因多態性的檢測可以在種雞生長發育的早期判斷篩選出高密度皮膚毛孔個體,降低了篩選的難度,縮短了育種的時間,可以節省一些成本,能有效提高冰鮮雞市場經濟效益。但是難點在于雞皮膚毛孔密度在屠宰后才能測定,而為了保障測量的準確性在群體基數上一定要夠大夠隨機才行。雞皮膚毛孔數量性狀遺傳力高,受環境影響較小。基于Wnt3a基因多態性可以分析篩選與皮膚毛囊密度相關的分子標記,以期為個體早期選育出優質皮膚毛囊密度性狀雞胴體提供理論依據,但在進行分子育種之前一定得有進一步驗證才準確。
綜上所述,本試驗在前人研究的基礎上在崇仁麻雞原種和B系中再次驗證了Wnt3a基因是影響雞皮膚毛囊生長發育的重要候選基因之一。由本研究結果得出,雖然是相同的基因相同的SNP位點,但在不同品種的雞皮膚毛囊上會體現出不一樣的表型和遺傳效應。
4 結 論
崇仁麻雞原種皮膚毛孔相較于B系更加細密,Wnt3a基因g.2555812 T>C位點的CC基因型和g.2555377 T>C位點的CC基因型是崇仁麻雞皮膚毛囊的有利基因型,可作為雞皮膚毛囊密度性狀的分子標記,進行分子標記輔助選擇育種培育出優質皮膚毛囊的肉雞。
