基于70 K SNP芯片分析濟寧青山羊保種群體的遺傳結構

張任豹,周東輝,周李生,高霄霄,柳 楠,賀建寧

(青島農業大學動物科技學院,青島 266109)

濟寧青山羊(Jining gray goat)屬于地方羔皮用山羊品種,其嘴唇、角、被毛和蹄均為青色,前膝為黑色,具有“四青一黑”的特征。濟寧青山羊是我國乃至世界上優異的種質資源,以其全年發情、多胎多羔、羔皮品質好、遺傳性穩定、耐粗抗病等品種特性而著稱,但其生長速度慢,加上近幾十年來,猾子皮市場的下滑和肉羊市場的興起,各地盲目引入其他品種進行改良,致使純種數量急劇下降。目前,該品種優質種公羊主要由保種場、養殖企業和散養農戶提供,然而,經過長期封閉繁殖,可能會造成近交程度的上升,對該品種的生存與保護帶來嚴重威脅[1-2]。

動物的家系結構、親緣關系模糊、錯誤的系譜記錄以及隨意的選育選配會降低該品種的遺傳多樣性,造成一定程度的近交,有效群體數量的減少,進而影響對該品種的提純復壯、繁殖更新[3]。單核苷酸多態性(SNP)主要是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態性。SNP標記與其他DNA分子標記相比具有不可比擬的優勢,SNP 具有數量多、分布廣、突變率低、遺傳穩定性高、多態性豐富、準確性較高、成本低等優點[4]。當前全基因組SNP芯片在研究動物的遺傳多樣性、親緣關系、家系結構等方面得到了廣泛的應用[5]。濟寧青山羊是我國珍貴的山羊遺傳資源,在養羊生產和種質創新中做出了重要貢獻,已實現了多點小群體活體保種,但仍需要對保種效果進行檢測和評價[6-10]。為了了解濟寧青山羊保種群體的保種效果,本研究利用Illumina 70 K Goat SNP芯片對40只濟寧青山羊全基因組范圍內的SNP進行檢測,分析群體遺傳多樣性、近交程度,厘清家系結構、親緣關系等,為濟寧青山羊的有效保護與合理開發利用提供指導。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

本研究所用40只濟寧青山羊的耳組織樣均采自山東省濟寧青山羊原種場。所有試驗羊均為成年羊,其中公羊23只(對原種場內公羊全部進行了采樣,基本包含了整個保種群體的血緣),母羊17只。將采集的耳組織放置含有無水乙醇的凍存管中,記錄樣品的個體編號,24 h 內帶回實驗室,-20 ℃凍存。

1.2 試驗方法

1.2.1 濟寧青山羊全基因組DNA的提取 利用基因組DNA提取試劑盒(Vazyme)對每只山羊耳組織進行基因組DNA提取。利用超微量紫外分光光度儀Nano Drop ND-2000和瓊脂糖凝膠電泳試驗來檢測基因組DNA 的濃度和純度,判斷其質量是否合格。具體檢測方法如下:1)使用量程為2.5 μL的移液槍,從提取的DNA樣品中吸取1 μL加入至Nano Drop ND-2000超微量紫外分光光度計的加樣孔中,再將其調至到DNA測量選項進行檢測。2)配置1%的瓊脂膠,在瓊脂膠板滴孔中滴入4 μL PCR擴增體系,在電壓為120 V的電泳槽中電泳25 min,在UV凝膠電泳成像系統下拍照檢測電泳結果。

1.2.2 SNP分型及芯片數據質量控制 將提取合格的DNA樣品送至紐勤生物科技(上海)有限公司,進行基因型分型,本研究所有樣本都使用 Illumina 70 K Goat SNP芯片進行基因型分型。該芯片由內蒙古農業大學開發,是一款中密度SNP分型芯片,利用Illumina平臺定制,同時兼容了 Illumina 山羊52 K SNP芯片位點,最終保留了67 088個高質量SNPs,集成一款全新的山羊70 K SNP芯片。利用 Plink(V1.90)軟件對基因型數據進行質控,只保留分型質量最好的位點進行后續分析。質控標準為:只使用常染色體上的位點,SNP檢出率大于等于90%,個體檢出率大于等于90%,哈迪溫伯格P值大于等于0.000 001,最小等位基因頻率(minor allele frequency, MAF)大于等于0.01。

1.2.3 濟寧青山羊保種群體遺傳多樣性分析 通過 Plink(V1.90)軟件計算各位點的遺傳多樣性參數,包括有效等位基因數、最小等位基因頻率(MAF)、期望雜合度(He)、觀測雜合度(Ho)、多態信息含量(PIC)和多態性比例標記(PN),以此來了解濟寧青山羊群體的遺傳多樣性。

PN指的是在目標群體中表現為多態的位點占總位點的比例。首先使用Plink軟件計算出每個位點的最小等位基因頻率(MAF),然后使用R腳本計算PN,利用如下公式計算PN。

公式中,M為表現多態的位點數,N為總的位點數。

He指的是群體中任一個體的任一位點是雜合的概率;Ho指的是群體中某一位點是雜合子的個體數占總個體數的比例,用如下公式計算。

其中,n為群體的總個體數,N為總的位點數,Hk為位點k的雜合個體數,Pki為位點k等位基因i的頻率。

PIC是衡量基因變異程度高低、反映遺傳信息多少的指標,PIC利用如下公式計算。

公式中Pi和Pj分別為第i個和第j個等位基因頻率,n為等位基因數。

有效等位基因數是指在理想群體中,一個基因座上產生與實際群體中相同的純合度所需的等位基因數,它等于實際群體的純合度的倒數。MAF是指在給定群體中的不常見的等位基因發生頻率。

1.2.4 濟寧青山羊保種群體親緣關系分析 利用GCTA工具構建G矩陣,采用 Plink(V1.90)軟件構建狀態同源(IBS)距離矩陣,分析保種群體個體間的親緣關系,并使用R軟件繪制IBS距離矩陣和G矩陣結果的熱圖。

1.2.5 濟寧青山羊保種群體的家系結構分析 利用Plink(V1.90)軟件對質控后的數據進行主成分分析,采用R語言腳本繪制主成分的二維圖,分析被測濟寧青山羊的群體結構,實現群體分層可視化。

1.2.6 基于ROH的近交程度分析 使用Plink(V1.90)計算得到每個樣本的ROH長度,基于ROH的近交系數是通過計算個體中ROH片段的總長度占常染色體基因組總長的比例。因此,個體中ROH的總長度越長或數量越多,該個體的近交系數就越高。

其中,k是個體中ROH的數量,L是基因型數據覆蓋的常染色體基因組的長度(山羊的常染色體基因組長約為2 468 749.279 kb)。

2 結 果

2.1 濟寧青山羊全基因組DNA提取質量檢測結果

利用超微量紫外分光光度儀Nano Drop ND-2000和凝膠電泳試驗來檢測基因組DNA的濃度和純度,判斷其質量是否合格,表1為部分濟寧青山羊DNA樣本純度檢測結果,A260 nm/A280 nm的比值在1.8～2.0間。圖1顯示,DNA條帶單一,表明DNA純度高,質量合格,可用于后續分析。

圖1 基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳結果Fig.1 Genomic DNA detected by agarose gel electrophoresis

表1 濟寧青山羊 DNA 樣本純度檢測結果Table 1 The test results of DNA purity of Jining gray goats

2.2 濟寧青山羊保種群體遺傳多樣性分析

SNP芯片共檢測到了67 088個SNPs,個體基因型檢出率為98%,通過 Plink(V1.90)軟件對數據質控,剩余的有效SNPs有57 991個,多態性比例標記(PN)為85.5%,表明此芯片適用于濟寧青山羊遺傳多樣性分析。經過Plink(V1.90)軟件對各位點進行統計,在 40個個體中共檢測到了68.87個有效等位基因,平均有效等位基因數(effective number of allele)為 1.697,最小等位基因頻率(MAF)為0.293,各位點PIC在 0～0.375 之間,平均PIC為 0.283;該群體平均觀察雜合度(Ho)為 0.409,平均期望雜合度(He)為 0.418,He略高于Ho。

2.3 濟寧青山羊保種群體親緣關系分析

通過構建G矩陣,分析被測濟寧青山羊群體的親緣關系。整個群體的G矩陣的可視化結果如圖2所示,結果表明,大部分濟寧青山羊個體間的親緣關系較遠,但也有部分個體之間存在較近的親緣關系。

G矩陣結果中,每個小方塊代表樣本兩兩之間的親緣關系值,該值越大越接近紅色,即兩個體親緣關系越近In the G matrix results, each small square represents the value of the relationship between two pairs from the first sample to the last one, the larger the value, the closer it is to red, that is, the closer relationship between two individuals圖2 G矩陣可視化結果Fig.2 G matrix visualization results

通過構建IBS距離矩陣,研究比較了40只濟寧青山羊之間的遺傳距離,結果顯示被測濟寧青山羊保種群體的IBS值在 0.174～0.396之間,其平均遺傳距離為0.333 4,表明濟寧青山羊個體間差異較大,并存在較遠的遺傳距離。23只濟寧青山羊公羊的IBS值在 0.174 0～0.387 9 之間,其平均遺傳距離為0.330 3。整個群體的IBS距離矩陣的可視化結果如圖3所示,大部分被測濟寧青山羊個體間的親緣關系較遠,部分個體間存在較近的親緣關系。

IBS距離矩陣中,每個小方塊代表樣本兩兩之間的遺傳距離值,該值越大越接近紅色,即兩個個體的遺傳距離越大,反之亦然Each small square in IBS distance matrix represents the genetic distance value between two pairs from the first sample to the last one,the larger the value, the closer it is to red, that is, the larger the genetic distance between two individuals, vice versa圖3 IBS距離矩陣可視化結果Fig.3 The visualization results of IBS distance matrix

2.4 濟寧青山羊保種群體的家系結構分析

從主成分分析圖4可以看出,整個濟寧青山羊群體中個體間的親緣關系不太緊密,以第一主成分為橫軸,以第二主成分為縱軸,左上側的JNQ17、JNQ18、JNQ09聚在一塊,右上側的JNQ04、JNQ12聚在一塊,JNQ16、JNQ21聚在一塊,JNQ22、JNQ02、JNQ08、JNQ03、JNQ05聚在一塊,其他公羊聚在一塊,表明該濟寧青山羊保種群體可能由多個家系構成。左下側的兩個個體聚在一塊,說明它們之間遺傳距離較遠,同時可以看出部分公羊與母羊聚集一起,表明這部分的濟寧青山羊遺傳距離較近。

圖中帶紅色標記編號的個體為公羊,黑色圓點表示母羊The individuals with red marks in the figure are rams, and the black dots indicate ewes圖4 主成分分析圖Fig.4 The results of principal component analysis

鑒于公羊對于整個保種群體的重要性,將公羊樣本提取出來單獨做聚類分析,以此來判斷它們之間的親緣關系遠近。以公羊間分子親緣系數0.1為標準進行聚類,將23只公羊劃分為14個家系。圖中相同顏色標注的樣本被評估為同一個家系,在進化樹分析中被聚類在較小的分類單元中。結果如圖5所示,現有的公羊樣本可以分為14個家系,分別命名為家系 1、家系 2、家系3……家系14,分別有 1、1、1、1、1、1、1、1、1、3、1、1、2、7只公羊。

2.5 基于ROH的近交程度分析

在40個樣本中共鑒定出347個ROHs,其中1～5 Mb數量最多,約占42.65%(圖6),ROH片段平均覆蓋基因組約11%,ROH在29條常染色體上的分布見圖7,可以看出,18號和12號染色體上的 ROH 數量最多,為20個,27號和22號染色體ROH數量最少,約為6個;個體ROH長度的樣本數分布如圖8所示,每個濟寧青山羊個體的ROH總長度在0～900 Mb,平均ROH長度為115.37 Mb,個體 ROH 長度在 0～100 Mb 內的個體數比例最大,約占33%。同時發現個體ROH長度在 200～300 Mb 和400～700 Mb之內的個體數很少,平均每個個體含有8.68個ROH,在沒有家系記錄的情況下,FROH可以作為近交估計的替代方法,該種群的平均近交系數為0.047 9,近交程度較低,群體遺傳多樣性豐富(圖9)。

圖6 濟寧青山羊群體的ROH長度分布Fig.6 Distribution of ROH length in Jining gray goats

圖7 每條染色體上的ROH數量分布Fig.7 The quality distribution of ROH on each chromosome

圖8 濟寧青山羊個體ROH長度的樣本數分布Fig.8 Distribution of ROH length samples in Jining gray goats

小提琴圖主要用于展示數據的分布,中心的白色的點代表群體FROH的中位數。小提琴圖的寬窄表示群體FROH的概率密度分布The violin diagram mainly show the distribution of data, and the white point in the center represents the median of population FROH. The width of the graph indicates the probability density distribution of the population FROH圖9 基于ROH的近交系數FROH的分布圖Fig.9 Distribution plot of FROH based on ROH

3 討 論

動物的遺傳多樣性研究多采用微衛星多態性(SSR)和單核苷酸多態性(SNP)的方法,但用SNP芯片分型的方法報道山羊的遺傳多樣性則很少[11-16]。SNP標記被證明比SSR標記有更高的準確性,已被廣泛應用于動物進化研究和遺傳關系鑒定等[17-22]。Stella等[23]利用山羊50 K Goat SNP芯片對來自35個國家148個群體共4 653只山羊個體,進行了種群遺傳多樣性研究,研究了全球山羊的種群遺傳結構、群體歷史選擇特征、遷移路線和環境適應性等,結果表明不同品種山羊的基因組和地理環境之間存在密切聯系,這為在全球范圍內研究山羊適應性等奠定了基礎。本研究中使用的山羊70 K SNP分型芯片由內蒙古農業大學開發,是一款中密度SNP分型芯片,利用Illumina平臺定制,同時兼容了 Illumina 山羊52 K SNP芯片位點,最終保留 67 088 個高質量SNPs位點,集成一款全新的山羊70 K SNP芯片。該芯片是國內首款具有自主知識產權的山羊中密度芯片,其應用領域包括全基因組關聯分析、基因組選擇、群體遺傳及選擇進化研究、親子鑒定、親緣關系及種質資源鑒定等[24-26]。該款芯片在濟寧青山羊群體中進行測試,結果表明基因分型成功,SNP檢出率大于98%。從SNP密度分布圖來看,質控前后SNP的分布較為均勻,缺失片段很少,質量合格,可用于本次試驗分析。

本研究利用全基因組SNP信息從遺傳多樣性、親緣關系、家系結構、近交程度等方面評估濟寧青山羊保種群體的保種效果。通過雜合度、有效等位基因數、多態信息含量等參數度量群體遺傳多樣性。王可等[6]利用12個微衛星標記分析了濟寧青山羊遺傳多樣性,結果發現所有微衛星標記PIC均大于0.5,平均PIC為0.73,均為高度多態標記,遺傳多樣性豐富;各標記的平均Ho約為0.73,平均He約為0.76;平均有效等位基因數約為4.727。在本研究中,平均Ho為0.409,平均He為0.418,各位點PIC在 0～0.375 之間,平均PIC為 0.283,平均有效等位基因數約為1.697。可以看出,利用全基因組SNP信息檢測的結果比利用SSR檢測的結果明顯降低,可能與SNP標記呈二態性有關,即SNP標記通常只能檢測到兩個等位基因,而SSR標記可以檢測到較多的等位基因[27-31]。He略高于Ho,表明濟寧青山羊保種群可能存在雜合子缺失,同時也可能有小部分引進了外來血緣,需要繼續加以純化,這一結果與王可等[6]利用微衛星方法得出的結果一致。

血統對動物遺傳學和育種研究至關重要。在養殖生產中,通常根據系譜鑒定畜禽的身份信息,在養殖規模較小時,利用系譜來鑒定畜禽親子關系準確性較好,但是隨著養殖業的發展工廠化、規模化、智能化、數字化,這種傳統記錄方式在現代畜牧生產中存在許多弊端,無法確定親子關系[32-34]。研究表明,可以通過遺傳關系和個體間的遺傳距離來構建家系[35-36],袁嬌等[37]利用“中芯一號”50 K SNP芯片對通城豬的全基因組SNP進行掃描,通過IBS距離矩陣和G矩陣分析了該種群的親緣關系、遺傳結距離;通過主成分析構建了公豬的家系結構,結果表明通城豬保種群無明顯的群體分層,保種效果良好。本研究采集的樣本均來自同一原種場,該原種場在一段時間內一直處于封閉繁殖狀態,一些個體不可避免地有近親或遠親。IBS距離矩陣和G矩陣均表明部分個體之間存在密切的親緣關系,因此在繁殖保護過程中,應注意公羊與母羊的交配工作,防止近親繁殖帶來的風險。主成分分析表明,整個濟寧青山羊群體中個體間的親緣關系不太緊密,表明該濟寧青山羊保種群體可能由多個家系構成。考慮到公羊在整個保種群體的重要性,單獨對公羊進行了聚類分析、家系構建,以公羊間分子親緣系數0.1為標準進行聚類,將23只公羊劃分為了14個家系,高于國家級保種場最低6個不同家系的要求。同時發現部分家系數量較少,因此在后續的保種利用工作中要及時關注各家系濟寧青山羊的數量,對家系數量少的應進行適當擴群,控制一定的近交水平,確保家系結構維持平衡。

為了保持種群不受外來品種的影響,我國的畜禽保種群體大多采取閉鎖繁殖的方式,但這可能會造成一定程度的近交,造成該品種遺傳多樣性降低,有效群體數量減少。長純合片段是個體內純合基因型的連續片段,由親代將同源單倍型完整地傳遞給子代所產生的。長的ROH指示發生在較近時期的親緣關系,越多說明家系內存在近交的可能性越高;短的 ROH指示發生在較遠時期的親緣關系,現有系譜通常已不能解釋這些親緣關系[38-39]。Islam等[40]利用山羊50 K芯片分別對濟寧青山羊、中衛山羊、阿爾巴斯絨山羊種公羊全基因組SNP信息進行掃描、通過親緣關系分析和近交系數計算,結果表明中衛山羊場的保種群家系數達17個,高于國家級保種場最低6個不同家系的要求。評價進一步發現,中衛山羊品種ROH短片段較多、群體近交系數低(0.017)、有效群體數量較高,該發現表明保種群體的遺傳多樣性較高,為中衛山羊保種群的管理措施制定及種公羊育種計劃提供新的思路。本研究中,濟寧青山羊共檢測到347個ROH片段,ROH數量較少,表明在歷史上對濟寧青山羊的選擇馴化強度低。同時發現濟寧青山羊群體ROH長度與頻率可能成反比(圖7),濟寧青山羊群體的ROH長度分布與頻率的關系在0～20 Mb滿足這個規律,當ROH長度大于20 Mb,可能在此區域受到了密集選擇。整個群體平均近交系數為0.047 9,近交系數較小。但也發現有部分個體的近交系數較高,超過了0.3,為降低群體近交增量,同一家系的公、母羊不建議進行配種。

4 結 論

本研究基于70 K Goat SNP 分析了濟寧青山羊保種群體的遺傳多樣性,發現濟寧青山羊保種群體近交程度較低,遺傳多樣性較豐富,群體內家系多,但各家系個體數較少,需要制定合理的配種計劃,確保家系結構保持平衡,同時應將該品種資源的保護與開發利用相結合,不斷推進該品種資源的選育,加快從資源優勢向經濟優勢轉化。