FGFs/FGFRs及其介導信號通路基因的異常表達影響犏牛未分化精原細胞增殖活性

張 鵬,王明秀,敬科民,彭 巍,田 園,李雨謙,付長其,舒 適,鐘金城*,蔡 欣*

(1.西南民族大學 青藏高原動物遺傳資源保護與利用四川省、教育部重點實驗室,成都 610041;2.青海大學畜牧獸醫科學院,西寧 810016)

犏牛是雌牦牛和雄黃牛的種間雜交后代,是典型的雄性不育動物。組織學研究發現,犏牛垂體前葉促性腺激素細胞發育不良,因而導致卵泡刺激素(FSH)分泌不足,影響了曲細精管的發育,從而使生精上皮發育受阻[1]。細胞學研究表明,犏牛精子發生在減數第一次分裂時期停滯,粗線期初級精母細胞發生凋亡,導致附睪中沒有成熟的精子[2],并且犏牛支持細胞的增殖活性和生精細胞的分化關鍵功能基因的表達均存在缺陷[3]。遺傳學研究發現,在精子發生過程中參與細胞增殖[4]、雙鏈DNA斷裂和修復[5-6]以及聯會[7]的基因都有不同程度的下調和甲基化。

成纖維細胞生長因子對未分化精原細胞的自我更新和抑凋亡起重要作用。FGF2可以通過增加SSCs(spermatogonial stem cells)中Ras(mitogen-activated protein kinase 1)通路中ERK的磷酸化上調SSC中ETV5(ets translocation variant 5)和Bcl6b(B-cell/lymphoma 6 member B protein)的表達[8],促進SSCs的增殖[9]。FGF8與FGFR1結合后激活Ras信號通路誘導GFRα1(GDNF family receptor alpha 1)和RET(Ret proto-oncogene)的表達,抑制SSCs的分化[10]。FGF5通過激活Ras通路中的ERK信號增強ETV5、SHISA6(shisa family member 6)和ID4(inhibitor Of DNA binding 4)等基因的表達,抑制Ngn3(neurogenin 3)、Sox3(SRY-box transcription factor 3)和Piwil4(Piwi like RNA-mediated gene silencing 4)等基因的表達,從而促進SSCs的增殖[11]。體細胞表達的FGF9也能通過p38(mitogen-activated protein kinase 14)-MAPK信號通路上調ETV5和Bcl6b的表達,促進SSC的增殖[12]。FGF4和FGF21通過Ras通路[13-14]抑制未分化精原細胞的凋亡。

FGF家族成員能顯著促進未分化精原細胞的增殖活性,而犏牛未分化精原細胞數量稀少[15],因此研究FGF家族成員對犏牛未分化精原細胞增殖的影響有重要意義。本研究通過CCK-8、EDU染色檢測了牦牛和犏牛未分化精原細胞的增殖活性;通過RT-qPCR檢測了6種FGF家族成員、3種FGF受體、FGF介導的Ras和MAPK信號通路基因和與未分化精原細胞增殖和分化相關基因的差異表達。本研究旨在為進一步解釋犏牛生精停滯提供新的思路和線索。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

二氧化碳培養箱(Model 3111,Thermo),倒置熒光顯微鏡(Axio Observer 3,Zeiss),實時熒光定量PCR儀(A28140,Thermo),細胞計數儀(Thermo Countess II,Thermo),酶標儀(1510,Thermo);特級胎牛血清(FB25015,CLARK),DMEM高糖培養基(SH30021.01B,Hyclone),4%多聚甲醛(P1110,索萊寶)。

于四川省阿壩州紅原縣選取24月齡公麥洼牦牛和F1代公犏牛各3頭,取其睪丸組織。用滅菌PBS將睪丸組織沖洗干凈,去除附睪及睪丸白膜。經75% 酒精噴灑消毒后用滅菌的剪刀將睪丸組織沿縱膈切開,部分睪丸組織放入有4% 多聚甲醛的15 mL離心管中;部分睪丸組織進行玻璃化冷凍。本試驗采用的牦牛和犏牛的未分化精原細胞是消化玻璃化冷凍睪丸組織得到的,是實驗室已經鑒定過的細胞。

1.2 HE染色

將睪丸組織從4%多聚甲醛中取出,自來水沖洗過夜。將組織切成大小合適的組織塊,放入包埋盒中,并用鉛筆做好標記。依次放入50% 乙醇、75% 乙醇、85% 乙醇、95% 乙醇和無水乙醇中各1 h。然后依次放入石蠟I、石蠟II和石蠟III 中各30 min。切片機切片,將石蠟切片依次放到二甲苯I、二甲苯II、二甲苯III中各15 min,無水乙醇I、無水乙醇II、85% 乙醇、75% 乙醇中各5 min,并用蒸餾水清洗。石蠟切片入蘇木素中染2 min,自來水漂洗,1%鹽酸酒精分化數秒,自來水漂洗,然后1%氨水水溶液返藍1 min,流水沖洗,放入伊紅染液中染色1 min,流水漂洗。將切片依次置于75% 乙醇、85% 乙醇、95% 乙醇、無水乙醇和二甲苯中分別浸泡10 min,中性樹膠封片,最后鏡檢。

1.3 ImageJ測量生精小管基底膜到管腔中細胞分布位置的距離

將圖片導入到ImageJ后,以圖片中的標尺為基準,測量出牦牛和犏牛生精小管基底膜到管腔中細胞分布位置的距離(r)。如圖1B所示,生精小管的兩條白色虛線互相垂直且等分,每個生精小管取4個值(r1、r2、r3、r4),以平均值作為該生精小管的r值。

A. 牦牛;B. 犏牛。SG、SC、RS、LC和PC分別為精原細胞、精母細胞、圓形精子細胞、間質細胞和管周肌樣細胞。C. 牦牛和犏牛生精小管基底膜到管腔的距離,即圖1B中r1-r4的均值。*. P<0.05;**. P<0.01,下同A. Yak; B.Cattleyak. SG, SC, RS, LC and PC are spermatogonia, spermatocyte, round sperm cell, leydig cell and peritubular myoid cell, respectively. C.The distance from basal membrane of seminiferous tubule to lumen of yak and cattleyak, namely, the mean of r1-r4 in figure B. *. P<0.05;**. P<0.01, the same as below圖1 牦牛和犏牛睪丸組織HE染色(40×)Fig.1 HE staining of yak and cattleyak testis(40×)

1.4 CCK-8檢測

將牦牛和犏牛的試驗組和對照組的未分化精原細胞接種于96孔板中,濃度為2×104個·mL-1,終體積為100 μL。分別于不同的培養基中進行培養。每種處理5個重復。在0、24、48、72和96 h時分別加入10 μL CCK-8 Solution (A311,Vazyme,中國),在37 ℃培養箱中孵育2 h,用酶標儀檢測450 nm處的吸光值。

1.5 細胞群體倍增時間PDT(population doubling time)檢測

將牦牛和犏牛的試驗組和對照組的未分化精原細胞接種于12孔板中,濃度為2×106個·mL-1,終體積為1.5 mL。分別于不同的培養基中進行培養。每種處理3個重復。在培養48 h后,用Countess? II進行細胞計數。按照公式(1)計算細胞群體倍增時間。

(1)

其中,t為培養時間,N0為初始培養的細胞數量,Nt為培養t時間后的細胞數量。

1.6 EDU染色

牦牛和犏牛的未分化精原細胞用4%多聚甲醛固定30 min,用2 g·L-1甘氨酸中和,用PBS洗滌,然后種植在粘附載玻片上。0.5% Triton X-100 (100 μL)滲透10 min后,載玻片上的細胞用EdU染色30 min (100 μL)。用DAPI將細胞核染色30 min,然后于顯微鏡下記錄圖像。

1.7 RNA的提取

懸浮生長的細胞收集后,500 G、4 ℃離心6 min,棄上清。加入1 mL PBS重懸浮細胞,將細胞稀釋至1×107個·mL-1,每個1.5 mL Rnase-free離心管分裝1 mL細胞懸液。500 G、4 ℃再次離心6 min,棄上清。加入1 mL Trizol,混勻后在室溫下靜置10 min。加入200 μL氯仿,渦旋振蕩混勻15 s,室溫下靜置2 min。12 000 r·min-1、4 ℃離心10 min。將上層的透明相吸到新的1.5 mL Rnase-free離心管中,加入500 μL異丙醇,混勻后室溫靜置10 min。12 000 r·min-1、4 ℃離心10 min。棄上清,加入1 mL 75% 乙醇,輕輕洗滌沉淀。7 500 r·min-1、4 ℃離心5 min。棄上清,加50 μL Rnase-free H2O,溶解RNA。用超微量核酸蛋白測定儀檢測RNA的濃度及純度。將剩余RNA進行逆轉錄反應或置于-80 ℃保存。

1.8 逆轉錄PCR (RT-PCR)

利用HiScript? III RT SuperMix for qPCR (+ gDNA wiper) 試劑盒 (R323-01,Vazyme,中國) 將“1.7”中提取的RNA逆轉錄為cDNA。

基因組DNA的去除:將4 μL 4×gDNA wiper Mix、1 μL 1 g·L-1RNA和11 μL Rnase-free H2O在200 μL離心管中輕輕吹打混勻,42 ℃放置2 min。

逆轉錄反應:向上述16 μL反應液中加入4 μL 5×HiScript III qRT SuperMix,在37 ℃放置15 min,85 ℃放置5 s。將最終的產物置于-20 ℃保存。

1.9 實時熒光定量PCR (RT-qPCR)

利用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix試劑盒 (Q711,Vazyme,中國) 以“1.8”中逆轉錄得到的cDNA為模板,進行實時熒光定量PCR反應。本試驗所用基因引物見表1。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1 RT-qPCR primer sequence

(續表1 Continued)

在200 μL離心管中將10 μL 2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix、0.4 μL F-primer、0.4 μL R-primer、1 μL cDNA和8.2 μL ddH2O混勻。

RT-qPCR反應:95 ℃放置30 s;95 ℃放置10 s,退火溫度放置30 s,40個循環;95 ℃放置15 s,60 ℃放置60 s,95 ℃放置15 s

1.10 統計分析

RT-qPCR以β-actin為內參,采用ΔΔCt法分析。使用GraphPad Prism 9.0.0統計軟件(GraphPad Inc.,美國)進行單因素方差分析,以確定是否具有統計學意義的差異 (P<0.05或P<0.01)。除非另有說明,否則每組試驗重復至少3次。

2 結 果

2.1 牦牛和犏牛睪丸組織的HE染色

通過對牦牛和犏牛睪丸組織的HE染色,發現牦牛的生精小管(圖1A)表現出正常的生理特征,從生精小管基底膜到管腔分布著類型豐富的生殖細胞,包括精原細胞、精母細胞和圓形精子細胞。而犏牛生精小管(圖1B)主要的生殖細胞為精原細胞,少見精母細胞。牦牛睪丸組織中生精小管與生精小管的間質部分的細胞數量也比犏牛豐富。另外,牦牛生精小管基底膜到管腔的距離((94.01±6.82) μm)顯著高于犏牛((53.42±1.40) μm) (P<0.01,圖1C),表明牦牛生精小管中的細胞數量比犏牛豐富。

2.2 牦牛和犏牛未分化精原細胞增殖活性的比較

通過計算牦牛和犏牛48 h未分化精原細胞的細胞群體倍增時間,發現犏牛未分化精原細胞細胞群體倍增時間((20.10±0.46)h)顯著大于牦牛((17.05±1.20)h,P<0.05),即犏牛未分化精原細胞的增殖活性低于牦牛(P<0.05,圖2A)。通過CCK-8試劑檢測牦牛和犏牛未分化精原細胞增殖活性,發現牦牛和犏牛的增殖曲線整體呈S型,但牦牛未分化精原細胞的增殖速率及活性都高于犏牛,尤其是在48 h之后(P<0.01,圖2B)。PDT和CCK-8的結果都表明,犏牛未分化精原細胞的增殖活性遠低于牦牛未分化精原細胞。EDU染色試驗也證明了犏牛未分化精原細胞增殖活性弱于牦牛(圖2C)。

A. 細胞群體倍增時間;B. CCK-8;C. EDU染色(200×)A. Cell population doubling time; B. CCK-8; C. EDU staining (200×)圖2 牦牛和犏牛未分化精原細胞增殖活性的比較Fig.2 Comparison of the proliferative activity of undifferentiated spermatogonia in yak and cattleyak

2.3 FGFs在牦牛和犏牛睪丸組織中的差異表達

通過qPCR檢測了FGFs家族成員FGF2、FGF4、FGF5、FGF8、FGF9和FGF21在牦牛和犏牛睪丸組織中的表達,發現FGF2、FGF8、FGF9和FGF21在犏牛睪丸組織中的表達約為牦牛睪丸組織中的一半(P<0.01),而FGF4和FGF5則在犏牛中以極低的水平表達(P<0.01,圖3A)。

A. FGFs在牦牛和犏牛睪丸組織中的表達;B. FGFRs在牦牛和犏牛未分化精原細胞中的表達A. Expression of FGFs in testis of yak and cattleyak; B. Expression of FGFRs in undifferentiated spermatogonia of yak and cattleyak圖3 FGFs及FGFRs在牦牛和犏牛中的表達Fig.3 Expression of FGFs and FGFRs in yak and cattleyak

2.4 FGFRs在牦牛和犏牛未分化精原細胞中的差異表達

通過RT-qPCR的方法檢測了牦牛和犏牛未分化精原細胞中FGF受體家族成員FGFR1、FGFR2和FGFR3的表達情況。結果顯示,3種FGFR在犏牛未分化精原細胞中的表達都顯著低于牦牛未分化精原細胞中的表達(P<0.01,圖3B)。

2.5 FGFs/FGFRs介導的Ras和MAPK通路基因在牦牛和犏牛未分化精原細胞中的差異表達

通過RT-qPCR檢測了FGFs/FGFRs介導的Ras和MAPK信號通路中基因的差異表達。結果如圖4A所示,在Ras通路基因中,只有HRas在犏牛未分化精原細胞中的表達高于在牦牛未分化精原細胞中的表達(P<0.01);ARaf(A-Raf proto-oncogene)在牦牛和犏牛未分化精原細胞中的表達沒有明顯差異;Raf1(Raf-1 proto-oncogene)、BRaf(B-Raf proto-oncogene)、MEK1(mitogen-activated protein kinase kinase 1)、ERK都是在牦牛未分化精原細胞中的高表達(P<0.01,圖4A)。在MAPK通路基因中,p38、MEKK3 (mitogen-activated protein kinase kinase 3)、MEKK6(mitogen-activated protein kinase kinase 36)和ASK1(mitogen-activated protein kinase kinase kinase 5)都在牦牛未分化精原細胞中的表達顯著高于在犏牛未分化精原細胞中的表達(P<0.01,圖4B)。

A. FGFs/FGFRs介導的Ras通路基因在牦牛和犏牛未分化精原細胞中的表達;B. FGFs/FGFRs介導的MAPK通路基因在牦牛和犏牛未分化精原細胞中的表達;C. 與增殖相關基因在牦牛和犏牛未分化精原細胞中的表達;D. 與分化相關基因在牦牛和犏牛未分化精原細胞中的表達。ns.無顯著性差異A. Expression of Ras pathway genes mediated by FGFs/FGFRs in undifferentiated spermatogonia of yak and cattleyak; B. Expression of MAPK pathway genes mediated by FGFs/FGFRs in undifferentiated spermatogonia of yak and cattleyak; C. Expression of genes related to proliferation in undifferentiated spermatogonia of yak and cattleyak; D. Expression of genes related to differentiation in undifferentiated spermatogonia of yak and cattleyak. ns. No significant difference圖4 FGFs通路基因及與增殖和分化相關基因在牦牛和犏牛未分化精原細胞中的表達Fig.4 Expression of FGFS pathway genes and genes related to the proliferation and differentiation in undifferentiated spermatogonia of yak and cattleyak

受Ras通路調控的與細胞增殖相關的基因中,SHISA6和ID4在犏牛未分化精原細胞中的表達明顯高于在牦牛的表達(P<0.01),而ETV4、GFRα1、Ret和TAF4B(TATA-Box binding protein associated factor 4b)都是在牦牛未分化精原細胞的表達量更高(P<0.05,圖4C)。受Ras和MAPK通路共同調控的與細胞增殖相關的基因中,ETV5和BCL6B也在牦牛未分化精原細胞的高表達(P<0.01,圖4C)。受Ras通路調控的與細胞分化相關的基因中,PIWIL4在犏牛未分化精原細胞中的表達量顯著高于牦牛,而SOX3、Stra8(stimulated by retinoic acid 8)和NGN3則在牦牛未分化精原細胞中的表達量更高(P<0.01,圖4D)。

3 討 論

對牦牛和犏牛睪丸組織的HE染色發現,犏牛睪丸組織中從生精小管基底膜到管腔的距離比牦牛薄得多,管腔中間出現空泡,而且生殖細胞類型較少,以精原細胞為主,表明犏牛雄性不育表現為生精小管發育異常,精子發生受阻,無法產生精子。另外,CCK-8、PDT和EDU染色結果也表明犏牛未分化精原細胞的增殖活性也明顯低于牦牛。這可能會導致犏牛睪丸組織中用于維持自我更新的干細胞數量不足,進而減少了用于分化產生精子的干細胞數量,進一步加重了雄性犏牛的生精停滯。

成纖維細胞生長因子是一個龐大的家族,目前已經發現了23個家族成員(FGF1-23),它們與5種FGF細胞表面受體(FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4和FGFRL1)相結合,激活下游的信號通路,影響細胞的行為[16]。目前,已經證實了FGF2、FGF5、FGF8和FGF9在哺乳動物未分化精原細胞中與相應的受體結合,以維持未分化精原細胞的自我更新[8-11],而FGF4和FGF21具有抗凋亡的作用[13-14]。本研究結果顯示,6種FGF家族成員在犏牛睪丸組織中的表達都明顯低于其在牦牛中的表達,3種FGF受體也在犏牛未分化精原細胞中低表達。因此,以上的結果表明,FGFs及其受體FGFRs的表達量不足是犏牛未分化精原細胞增殖活性低的原因之一。

FGFs/FGFRs介導多條信號通路調節細胞的行為。FGF9與FGFR3結合,通過ASK1-MEKK3/6-p38信號的級聯激活來維持未分化精原細胞的自我更新[12]。FGF2、FGF5、FGF8通過HRas-Raf1/ARaf/BRaf-MEK1-ERK信號的級聯激活促進未分化精原細胞的增殖[9-11]。FGF4[13]及FGF21[14]通過Ras-Raf-ERK信號級聯激活抑凋亡。本研究結果顯示,只有Ras通路中的HRas的表達量是在犏牛未分化精原細胞中的表達量高于牦牛,ARaf的表達量在兩種牛中沒有差異。其余的通路基因,包括MAPK通路中的ASK1、MEKK3、MEKK6和p38以及Ras通路中的Raf1、BRaf、MEK1和ERK,都是在牦牛未分化精原細胞中的高表達。因此,犏牛未分化精原細胞增殖能力弱的另一個重要原因是FGFs/FGFrs介導的Ras和MAPK信號通路中的基因表達異常,導致FGFs/FGFRs介導的信號不能準確地調控與細胞增殖和分化相關的基因,降低了未分化精原細胞的增殖活性。

結果表明,受Ras通路調控的與未分化精原細胞增殖相關的基因中,ID4與SHISA6在犏牛未分化精原細胞中的表達量更高。ID4在小鼠中能決定未分化精原細胞的狀態,ID4+的未分化精原細胞主要維持自我更新,ID4-的未分化精原細胞則趨向于分化產生精子[17]。SHISA6是一種細胞固有的因子,能夠抑制Wnt的表達,而Wnt/β-catenin通路能促進未分化精原細胞的分化[18]。由于犏牛未分化精原細胞數量少,為維持用于自我更新的細胞的數量,犏牛未分化精原細胞通過上調SHISA6的表達以抑制分化,從而使得犏牛未分化精原細胞偏向自我更新而不是分化,間接導致了ID4表達的上調。

本研究也發現,與增殖相關的其他基因都是在牦牛未分化精原細胞中的表達更高。TAF4B是一種在性腺中特異表達的轉錄調節因子,能調控GFRα1和Ret的表達[19]。GFRα1和Ret是GDNF的受體[20-21],其介導的信號通路能促進未分化精原細胞的增殖,同時又能調控Etv5的表達[22]。Etv5既是FGF9和FGF5下游的調控基因[11-12],同時又參與調控Bcl6b的表達[23-24],用以維持未分化精原細胞的自我更新。Taf4b在犏牛未分化精原細胞中表達不足導致GFRα1和Ret表達下調,進而導致Etv5、Bcl6b的表達下調,降低了犏牛未分化精原細胞的增殖活性。ETV4與ETV5是同源蛋白,也與精原細胞增殖相關[25],其表達量不足也會降低犏牛未分化精原細胞的增殖活性。而犏牛未分化精原細胞增殖活性降低會導致未分化精原細胞數量少,沒有足夠的未分化精原細胞進入分化狀態產生精子。

另外,本研究還發現受Ras通路調控的與未分化精原細胞分化相關的基因中,Piwil4在犏牛未分化精原細胞中高表達,但Sox3、Ngn3和Stra8在犏牛中低表達。PIWIL4屬于Argonaute蛋白家族的Piwi分支,在動物生殖系中特異表達,其mRNA被提前轉錄,以mRNP的形式被存儲[26]。Piwil4在犏牛未分化精原細胞中的表達量更高,可能是由于犏牛精子發生被阻滯在減數分裂時期,導致Piwil4的mRNA被大量積累。Sox3是一種轉錄因子,與Ngn3啟動子區域中的保守區域結合,能直接調控NGN3的表達,以促進未分化精原細胞的分化[27]。NGN3+的細胞是準備進入分化的干細胞,其通過上調Stra8的表達促進減數分裂的進程[28]。犏牛未分化精原細胞數量少,不能進入分化態,下調與分化相關的基因Sox3的表達。Sox3的低表達導致沒有足夠的SOX3轉錄因子結合到的Ngn3啟動子上,進而下調了Ngn3的表達,也進一步下調了Stra8的表達,抑制了犏牛精原細胞的分化。Ngn3在犏牛未分化精原細胞中的表達顯著低于牦牛,表明犏牛未分化精原細胞群體中NGN3陽性的細胞占比較少,即犏牛未分化精原細胞更偏向于自我更新。

4 結 論

本研究發現,FGF家族成員(FGF2、FGF4、FGF5、FGF8、FGF9和FGF21)及其相應的受體(FGFR1、FGFR2和FGFR3)、FGFs所介導的信號通路中的基因(p38、Raf、BRaf、MEK1、ERK、MEKK3、MEKK6和ASK1)及與未分化精原細胞增殖相關的基因(ETV5、TAF4B、ETV4、BCL6B、GFRα1和Ret)都在犏牛的未分化精原細胞中的表達量不足導致犏牛未分化精原細胞的增殖活性顯著低于牦牛的未分化精原細胞,而犏牛未分化精原細胞增殖活性會降低導致未分化精原細胞數量少(圖5)。另外,與未分化精原細胞增殖相關的基因(SHISA6和ID4)及與未分化精原細胞分化相關的基因(SOX3、NGN3和Stra8)在犏牛未分化精原細胞中的表達量低表明犏牛未分化精原細胞是用于維持自我更新而不是分化產生精子。因此,FGFs/FGFRs介導的Ras和MAPK通路基因在犏牛未分化精原細胞中的異常表達,降低了犏牛未分化精原細胞增殖活性,減少了未分化精原細胞的數量,導致犏牛睪丸中沒有足夠的未分化精原細胞進入分化階段產生精子,這可能是犏牛生精停滯的一個重要原因(圖5)。

圖5 FGFs表達異常對犏牛生精停滯的影響Fig.5 Effect of abnormal expression of FGFs on spermatogenesis and stagnation of cattleyak