基于流式細胞術分選綿羊分泌型IgA包裹的消化道細菌

米 慧,彭 燦*,賀志雄,2*,譚支良,2

(1.中國科學院亞熱帶農業(yè)生態(tài)研究所 亞熱帶農業(yè)生態(tài)過程重點實驗室 畜禽養(yǎng)殖污染控制與資源化技術國家工程實驗室 湖南省畜禽健康養(yǎng)殖工程技術研究中心 農業(yè)部中南動物營養(yǎng)與飼料科學觀測實驗站 動物營養(yǎng)生理與代謝過程湖南省重點實驗室 中國科學院亞熱帶農業(yè)生態(tài)研究所公共技術中心,長沙 410125;2.中國科學院大學,北京 100049)

動物消化道定居著數量龐大的、動態(tài)的、高度復雜的微生物群落[1]。消化道微生物對宿主體內的營養(yǎng)代謝和免疫穩(wěn)態(tài)具有重要的調節(jié)作用,影響著宿主健康和疾病生理的各個方面[2]。分泌型免疫球蛋白A(secretory immunoglobulin A, sIgA)是動物消化道內主要的免疫球蛋白,具有保護宿主免受病原體和毒素侵襲、塑造腸道菌群結構、調控細菌行為等功能,在消化道內宿主-細菌穩(wěn)態(tài)維持中發(fā)揮著重要作用[3]。sIgA可以通過經典抗原特異性識別、非抗原特異性聚糖介導的相互作用以及微生物編碼超抗原結合等多種機制結合并“包裹”微生物[4-7]。研究表明,sIgA可同時包裹有益共生菌和病原菌,針對不同菌種和菌株表現出不同的包裹水平,例如與疾病相關的致病菌表現為高水平的sIgA包裹,而有益共生菌表現為較低水平的包裹[8-10]。同時,sIgA包裹對不同菌種和菌株的定植具有相反的影響:sIgA包裹能夠通過調節(jié)共生菌基因表達、增強黏膜適應能力以及提供微生物所需聚糖的方式增強有益共生菌的定植和生長,而通過中和作用、免疫排斥、調節(jié)代謝等途徑限制病原菌的定植或擴張[5,11-15]。sIgA缺乏或功能障礙可導致消化道微生物群落結構的改變,并與多種腸道疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關[16-17]。因此,對動物消化道內sIgA包裹細菌進行分選,利于對其中組成和功能的研究,從而有助于提升宿主-消化道微生物互作的理論認知。

目前,文獻報道的sIgA包裹細菌分選方法主要有流式細胞術[18]和免疫磁珠分離技術[19]。免疫磁珠分離技術具有操作簡單、且能有效消除脂肪和蛋白質等雜質干擾等特點[20-21],但分離過程需要準確把握磁響應時間,對人員操作要求高且磁珠捕獲率不穩(wěn)定[22]。流式細胞術(flow cytometry,FCM)是一種依托流式細胞儀,綜合了流體力學、免疫學、熒光化學技術和計算機技術的多學科的定量分析和分選方法。早期由于微生物細胞體積過小,細胞信號難以捕捉,FCM主要應用于動物細胞的分析檢測。近幾年,隨著熒光染料的發(fā)展,通過檢測染料放大的分子信號,FCM逐漸在微生物分析和分選中得以應用[18,23]。目前,基于不同種類細菌展現出的菌體大小、營養(yǎng)需求、菌體內特異抗原等特定生物學特性通過FCM進行分選,已成為微生物學的重要研究手段。

已有研究在小鼠和人類中利用FCM成功描述了總體細菌、sIgA包裹細菌以及未包裹細菌之間的差異[8-9],但在反芻動物中相關研究較少。因此,基于目前成熟的抗IgA抗體體系,本研究旨在開發(fā)一種有效且能從反芻動物消化道內容物樣本中分離sIgA包裹細菌的分選方法,以期為深入理解宿主sIgA如何影響消化道微生物,提升人們對反芻動物宿主-消化道微生物互作方面的理論認知。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用綿羊回腸內容物由中國科學院亞熱帶農業(yè)生態(tài)研究所畜禽健康養(yǎng)殖研究中心提供。選取4只健康成年綿羊,經頸靜脈放血致死后剖開腹部,迅速結扎食管和直腸,待胃腸道與胴體分離后,在各個部位分界點兩段結扎,分離胃腸道,取回腸中適量內容物樣品,分別迅速投入液氮中,之后存入-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗試劑及儀器

主要試劑:生物素標記兔抗山羊抗IgA抗體(Novusibio,美國),Alexa Fluor 488標記鏈霉親和素(Alexa Fluor 488-Streptavidin)染料(Bioss,北京),蛋白酶抑制劑(Solarbio,北京),兔血清(Solarbio,北京)、牛血清白蛋白(BSA)(Solarbio,北京),DAPI(Solarbio,北京),超純水為中國科學院亞熱帶農業(yè)生態(tài)過程重點實驗室自制。

主要儀器:流式細胞儀(Beckman Coulter,Moflo XDP,美國);多功能臺式離心機(Eppendorf,5804R,德國);渦旋儀(Scientific Industries,Vortex-Genie 2,美國)。

1.3 菌液制備

將回腸內容物以100 mg·mL-1的濃度懸浮于蛋白酶抑制劑溶液,并置于渦旋儀劇烈渦旋5 min進行均質化處理。均質化后在4 ℃條件下以400×g離心5 min,收集上清液并通過40 μm細胞過濾器轉入新離心管,隨后在4 ℃條件下以10 000×g離心10 min,收集細菌沉淀重新懸浮于染色緩沖液(1% BSA-PBS),獲得細菌懸液。

1.4 sIgA包裹細菌染色

取100 μL“1.3”中制備的細菌懸浮菌液在4 ℃條件下用5%兔血清封閉1 h;封閉結束加入生物素標記的兔抗山羊抗IgA抗體,在4 ℃條件下孵育20 min;抗體孵育結束,使用染色緩沖液洗滌細菌2～3次,加入Alexa Fluor 488-Streptavidin染料,在4 ℃條件下避光孵育20 min;染色完成的菌液使用染色緩沖液洗滌細菌3次,重懸于DAPI溶液中,避光保存,30 min內待上機檢測。

1.5 試驗條件優(yōu)化

1.5.1 門的設定 在流式分選過程中,首先要在流式圖譜中區(qū)分生物活性顆粒和非生物顆粒,因此設置PBS溶液作為陰性對照,以獲得背景信號,隨后通過前向散射光(forward scatter, FSC)和側向散射光(side scatter, SSC)建立FSC/SSC圖,將閾值設在SSC(0.04%)上,剔除背景噪音干擾和雜質(圖1A);隨后,利用核酸染料DAPI的熒光信號設門,建立DAPI/SSC圖(圖1B),區(qū)分樣品中的細菌顆粒和非生物顆粒,剔除非細菌顆粒,確定細菌群落信號;最后,利用兔抗山羊抗IgA抗體和Alexa Fluor 488-Streptavidin染料特異結合所產生的熒光信號設門,建立FITC/SSC圖(圖1C),圈出sIgA陽性信號即sIgA包裹菌群。

A. FSC/SSC圈門剔除雜質信號;B. DAPI/SSC圈門確定細菌信號;C. FITC/SSC圈門確定sIgA包裹細菌信號A. FSC/SSC gate to removed from the impurities signal; B. DAPI/SSC gate to determine the bacterial signal; C. FITC/SSC gate to determine the sIgA-coated bacteria signal圖1 流式檢測圖譜獲取sIgA包裹菌群流程Fig.1 The flow chart of sIgA-coated bacteria was obtained by flow cytometry

1.5.2 樣品上樣濃度的確定 將采集的4份回腸內容物采用“1.3”描述方法制備菌液,將菌液分別進行0、1∶10、1∶20、1∶50、1∶100以及1∶1 000倍稀釋,保持其他試驗條件一致,按照“1.5.1”方法操作,根據FSC/SSC圖、DAPI/SSC圖和FITC/SSC分別檢測各稀釋比例下的總信號顆粒數(TS)、細菌信號顆粒數(BS)和sIgA包裹細菌信號顆粒數(SS),計算細菌信號百分比與sIgA細菌包裹率,明確菌液最佳上樣濃度。同時,根據FITC/SSC圖譜確定不同稀釋比例下sIgA陽性細菌信號區(qū)位置。

細菌信號百分比=細菌信號顆粒數/總信號顆粒數×100%(BS/TS×100%)

sIgA細菌包裹率=sIgA包裹細菌數量/總細菌數量×100%(SS/BS×100%)

1.5.3 DAPI最佳工作濃度的確定 將采集的4份回腸內容物選用“1.5.2”確定的最佳樣本上樣濃度制備菌液,保持其他試驗條件一致,每份菌液平行取樣4次,分別加入1、5、10、20 μg·mL-1的DAPI溶液,上機將樣品依次選至FSC/SSC和DAPI/SSC圖譜,檢測細菌信號分布范圍及細菌信號百分比,評估DAPI細菌染色效率,選定DAPI最佳工作濃度。

1.5.4 抗體最佳使用量的確定 將采集的4份回腸內容物選用“1.5.2”確定的最佳樣本上樣濃度制備菌液,保持其他條件一致,每份菌液平行取樣4次,分別加入1、2.5、5、7.5 μL濃度為1 mg·mL-1的生物素標記的兔抗山羊抗IgA抗體,檢測sIgA陽性信號和sIgA細菌包裹率,評估抗體最佳用量。

1.6 方法的穩(wěn)定性和可重現性

取3份回腸內容物,分別平行取樣3次,根據“1.3”制備菌液,選用“1.5.2”、“1.5.3”和“1.5.4”確定的試驗條件,測定每個樣本的sIgA細菌包裹率,計算變異系數(CV),比較其重復性。

CV(%)= 標準誤差/平均值×100。

1.7 數據統(tǒng)計與分析

所有數據采用Excel 2019進行初步統(tǒng)計后,采用SPSS 22.0軟件的單因素ANOVA進行差異顯著性分析。試驗結果以平均值和均值標準誤表示,統(tǒng)計差異顯著性定義為P<0.05。

2 結 果

2.1 樣品上樣濃度

如圖2所示,除原液和10倍稀釋菌液外,其余樣本sIgA陽性細菌信號與陰性信號區(qū)分明顯;超過50倍稀釋菌液的sIgA陽性信號超出圖譜分析范圍,存在結果偏差。由表1可知,原液的TS、BS和SS顯著高于其余稀釋菌液(P<0.05),但20倍稀釋和40倍稀釋顯著提高了BS/TS和SS/BS比值(P<0.05)。上述結果表明,配制菌液時,可將濃度為100 mg·mL-1的原液稀釋20至40倍,即為2.5～5.0 mg·mL-1進行上樣。

表1 不同菌液濃度對流式圖譜總信號顆粒數、細菌信號顆粒數和sIgA陽性細菌信號顆粒數的影響Table 1 Effects of different bacterial sample concentration on the total number of signal particles, the number of bacterial signal particles and the number of sIgA-coated bacterial signal particles in flow chromatogram

圖2 sIgA陽性細菌信號區(qū)隨菌液濃度變化Fig.2 Changes of sIgA-coated bacterial signal with increasing bacterial concentration in a sample

2.2 DAPI最佳工作濃度優(yōu)化結果

如圖3所示,DAPI濃度為5 μg·mL-1時檢測出的細菌比例最高(圖3B),同時細菌信號與非細菌信號區(qū)分明顯(圖3A)。因此,DAPI最佳工作濃度5 μg·mL-1。

A. 細菌信號分布范圍;B. 細菌比例A. Bacterial signal distribution; B. Proportion of bacteria 圖3 DAPI最佳工作濃度的確定Fig.3 Determination of optimal working concentration of DAPI

2.3 抗體最佳使用量優(yōu)化結果

如圖4所示,sIgA陽性信號與陰性信號分群隨著抗體用量的增加而更加清晰(圖4A)。當抗體用量為5 μg時,可觀察到sIgA細菌包裹率顯著高于1和2.5 μg(P<0.05),同時sIgA細菌包裹率不再隨著抗體量增加提高(圖4B)。因此,抗體的最佳使用量為5 μg。

A. sIgA陽性信號分布;B. sIgA細菌包裹率。柱上不同字母表示差異顯著(P<0.05),相同字母或無字母標注表示差異不顯著(P>0.05)A. Distribution of sIgA-coated bacterial signal area; B. The percentage of sIgA-coated bacteria. Bars with different letters indicate significant differences (P<0.05), while with the same letter or no letter mark means no significant difference (P>0.05)圖4 抗體最佳使用量確定Fig.4 Determination of the optimal amount of antibody

2.4 方法的穩(wěn)定性和可重現性

如表2表明,在同等試驗條件下,3個回腸樣品的CV值均在5%以內,表明FACS穩(wěn)定性和重現性較好。

表2 方法的穩(wěn)定性和可重現性Table 2 Stability and reproducibility of the method

3 討 論

動物出生后隨著與母體和外界環(huán)境的接觸,各類微生物逐漸在動物消化道內定植,并隨著動物機體的發(fā)育、年齡增長以及日糧等多種因素的驅動,逐漸形成一個數量龐大的微生物群落。sIgA是消化道獲得性免疫的重要標志物,在消化道黏膜表面顯著分泌,并已證實能夠覆蓋一部分消化道微生物群,消化道的穩(wěn)態(tài)維持很大程度上依賴于sIgA的作用[11]。流式細胞儀是目前使用最為廣泛的細菌/細胞分選儀器,能夠通過利用免疫熒光對標記的細胞或細菌等微小顆粒作出分選,具有效率高、準確率高、易操作等特點[24]。目前,已有大量研究人員利用流式細胞術對人和小鼠胃腸段內sIgA包裹細菌進行研究,但分選過程中重要分選參數如門的設定及關鍵試劑的用量未見報道[25-27]。因此,建立綿羊sIgA包裹微生物分選方法并量化流式分選參數,有助于加深宿主-微生物間共生關系的理解,同時有利于sIgA包裹細菌的分析與分選的推廣應用。

在流式細菌分選過程中,流式細胞儀接收細菌樣品的熒光信號并通過轉換器轉換為數字信號以散點圖等形式呈現,最后可通過散點圖設門來獲得目標菌群[28]。因此,細菌樣品濃度對流式圖譜形成具有重要影響。劉倩和劉小杰[29]使用流式細胞術檢測水環(huán)境中細菌時發(fā)現,當樣品濃度過高時,水樣中菌體抱團,導致菌體計數存在誤差。梅仕良[30]對豆制品中菌落總數的檢測中,發(fā)現當上樣的濃度較大時,流式圖譜顯示的顆粒密集,各信號區(qū)邊界模糊,易造成設門不夠準確而使雜質設在門中;上樣濃度過低,圖譜中顆粒零散分布,則導致目標細菌不能全部設在門中,造成結果不足偏小存在誤差。鑒于這一特性,本試驗通過對菌液進行梯度稀釋,確定了內容物以2.5～5 mg·mL-1懸浮于染色緩沖液時,能兼顧設門的精確性和目標菌群數量,滿足后續(xù)試驗需求,為最佳的樣品上樣濃度。

一般情況下,流式圖譜主要采用散射光信號對樣品顆粒中的細菌信號進行初級區(qū)分和分析。但在實際檢測過程中,僅憑借散射光信號往往難以將顆粒外形與目標細菌非常接近或相似的物質或雜質區(qū)分[31]。因此,需要利用熒光染色技術來精確區(qū)分目標菌群。DAPI是一種核酸熒光染料,可以穿透細胞膜與雙鏈DNA結合產生比自身強20多倍的藍色熒光而發(fā)揮標記的作用[32]。一般而言,低濃度的DAPI溶液不容易穿透細胞膜,且在樣品量大的情況下需要足夠濃度的DAPI對目標細菌進行覆蓋。如Piriyakarnsakul等[33]研究發(fā)現,使用DAPI對酵母菌進行染色,酵母菌熒光信號強度隨著DAPI濃度升高而升高。在本方法中基于激發(fā)光波長和熒光染料之間的緊密關系[34],利用DAPI對內容物菌群染色。通過流式圖譜分析發(fā)現,DAPI工作濃度為5 μg·mL-1時,能夠有效覆蓋菌液樣品中菌群,并對樣品中的細菌信號和非細菌信號進行明確區(qū)分。同時,由于菌液中sIgA包裹菌群含量較多,需要加入合適的抗體含量保證檢測的準確性。在本方法中添加不同抗體量,發(fā)現當抗IgA抗體量設置為5 μg時,能夠覆蓋菌液的目標菌群,且能夠在對樣品中的sIgA陽性信號和陰性信號進行明確區(qū)分的同時避免過多抗體消耗。

4 結 論

本研究確立了一種流式細胞術細菌分選方法,對綿羊消化道sIgA包裹細菌進行標記并分選。對試驗結果進行分析得出:1)內容物最佳上樣濃度為2.5～5 mg·mL-1;2)DAPI最佳工作濃度為5 μg·mL-1;3)抗IgA抗體最佳使用量為5 μg。該方法專一性強、靈敏度高,可為研究反芻動物消化道sIgA包裹菌群以及宿主-微生物互作提供新的研究方法。