非洲豬瘟病毒感染相關(guān)調(diào)控基因以及毒力基因初步篩選

丁曉艷,何久香,周曉楊,周伃欣,李晉濤

(陸軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院軍事生物安全教研室,重慶 400038)

非洲豬瘟(African swine fever, ASF)是由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)感染導(dǎo)致的一種急性、出血性、烈性傳染病,各品種及不同年齡的豬群均易感,其發(fā)病率和死亡率均可達(dá)到100%。ASFV是雙鏈DNA病毒,包含外膜、衣殼、雙層內(nèi)膜、核心殼層和基因組5層結(jié)構(gòu),全長(zhǎng)為170～190 kb,有151個(gè)開(kāi)放閱讀框(open reading frame,ORF),編碼了多種病毒蛋白參與調(diào)控宿主的免疫應(yīng)答,維持其在宿主中的長(zhǎng)時(shí)間存活,導(dǎo)致非洲豬瘟的發(fā)生[1-3]。研究表明,在ASFV易感細(xì)胞表面存在許多病毒結(jié)合位點(diǎn),比如細(xì)胞脂質(zhì)膽固醇和CD163受體等,而病毒自身蛋白p54和p72在病毒的吸附中也發(fā)揮了一定的作用[4-6]。另外,ASFV可通過(guò)動(dòng)力素依賴性和網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞機(jī)制進(jìn)入宿主細(xì)胞,并利用囊膜和內(nèi)吞泡膜融合機(jī)制將病毒釋放到細(xì)胞質(zhì)中,其中肌動(dòng)蛋白和磷酸肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)在這個(gè)過(guò)程中發(fā)揮了重要作用[7]。一旦進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),ASFV從早期內(nèi)涵體移動(dòng)到晚期大囊泡體,在酸性環(huán)境中完成脫殼釋放出基因組進(jìn)行復(fù)制,pE248R參與膜融合[7-10]。雖然,關(guān)于非洲豬瘟病毒編碼蛋白的研究很多,但由于ASFV屬于高致病性病原微生物,其生物學(xué)特性復(fù)雜,基因組龐大,超過(guò)一半基因功能仍未知。同時(shí),ASFV對(duì)宿主的調(diào)控機(jī)制復(fù)雜多樣,ASFV逃逸宿主的免疫應(yīng)答致使弱毒活疫苗免疫保護(hù)力低以及造成病毒持續(xù)感染,導(dǎo)致現(xiàn)在尚無(wú)安全有效的疫苗面世[11-12]。因此研究ASFV逃逸宿主天然免疫分子機(jī)制,篩選并鑒定關(guān)鍵致病基因,對(duì)疫苗以及抗病毒靶向藥物的研發(fā)具有重要的科學(xué)意義和應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

3D4/21豬肺泡巨噬細(xì)胞購(gòu)自重慶巴而思生物有限公司。Lipofectamine?3000試劑購(gòu)自Invitrogen(USA);組織/細(xì)胞快速提取試劑盒購(gòu)自BOER(China);PrimeScriptTMRT Reagent Kit、TB Green? Premix ExTaqTMII購(gòu)自TaKaRa(Japan);LightCycler? 96 system購(gòu)自Roche (USA);Opti-MEM I培養(yǎng)基等材料為實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方法

1.2.1 數(shù)據(jù)集的下載與分析 從基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(kù)(Gene Expression Omnibus,GEO)下載ASFV強(qiáng)毒株P(guān)ig/Heilongjiang/2018(Pig/HLJ/18)感染單核巨噬細(xì)胞不同時(shí)相點(diǎn)RNA-seq測(cè)序數(shù)據(jù)。使用R軟件包“edgR”,篩選出P≤0.05,log2FC≥1的差異基因。利用R v. 3.6.1(R Core Team,Vienna,Austria)和Graphpad prism 6.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和可視化分析。使用在線工具進(jìn)行維恩分析(計(jì)算并繪制自定義維恩圖,http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)。強(qiáng)毒株Georgia 2007/1(GRG)和弱毒株OURT88/3感染全血轉(zhuǎn)錄組差異基因數(shù)據(jù)來(lái)源于文獻(xiàn)[13]。

1.2.2 可視化熱圖分析 通過(guò)在線工具M(jìn)orpheus(https://software.broadinstitute. org/morpheus/)對(duì)差異基因進(jìn)行熱圖可視化分析。

1.2.3 基因功能富集分析 使用Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)(https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1)對(duì)差異基因進(jìn)行基因本體論(GO)類別進(jìn)行可視化。

1.2.4 蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 PPI網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)使用交互基因檢索工具(STRING)數(shù)據(jù)庫(kù)(http://string-db.org)獲得,并使用Cytoscape v. 3.6.1(https://cytoscape.org/download.html)進(jìn)行可視化。

1.2.5 體外瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 強(qiáng)毒株Georgia 2007/1與弱毒株OURT88/3的差異基因交付于生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行合成,并構(gòu)建至pCDNA3.1(+)載體上。構(gòu)建好的質(zhì)?；騪CDNA3.1空載質(zhì)粒在3D4/21豬肺泡巨噬細(xì)胞細(xì)胞中過(guò)表達(dá)的體外瞬時(shí)轉(zhuǎn)染采用Lipofectamine?3000(Invitrogen,USA)試劑。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。操作步驟如下:將細(xì)胞以2×105·mL-1接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板,每孔接種2 mL,置于含體積分?jǐn)?shù)5%CO2的37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)過(guò)夜,待細(xì)胞密度為80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將2 μg質(zhì)粒和5 μL P3000 reagent 加入125 μL Opti-MEM I培養(yǎng)基,將7.5 μL Lipofectamine 3000 reagent轉(zhuǎn)染試劑加入125 μL Opti-MEM I培養(yǎng)基。將轉(zhuǎn)染試劑加入稀釋后的質(zhì)粒中,輕輕混勻室溫放置15 min。將細(xì)胞培養(yǎng)板中的完全培養(yǎng)基換成無(wú)血清培養(yǎng)基,然后將混合液加入到細(xì)胞培養(yǎng)板中。轉(zhuǎn)染24 h后收集細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.6 實(shí)時(shí)定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè)基因相對(duì)表達(dá)量 上述收集的細(xì)胞使用組織/細(xì)胞快速提取試劑盒進(jìn)行提取,嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作。隨后使用PrimeScriptTMRT Reagent Kit進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。使用TB Green? Premix ExTaqTMII和LightCycler? 96 system進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。反應(yīng)條件:預(yù)變性 95 ℃ 30 s;變性95 ℃ 5 s, 60 ℃ 30 s,40個(gè)循環(huán);熔解曲線反應(yīng)條件為逐漸升溫至95 ℃。PCR反應(yīng)結(jié)束后,檢查熔解曲線與擴(kuò)增曲線是否異常,導(dǎo)出試驗(yàn)數(shù)據(jù),目的基因的表達(dá)水平使用-ΔΔct方法計(jì)算。目的基因檢測(cè)所使用的引物為UBB-F:5′-TTGTTGGCGGTTTCGCTGTT-3′;UBB-R: 5′-TTTGACCTGTGAGTGAAGGCA-3′。GAPDH-F:5′-TCGGAGTGAACGGATTTGGC-3′;GAPDH-R:5′-TGACAAGCTTCCCGTTCTCC-3′。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析 使用GraphPad Prism v6.0軟件對(duì)所有統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。組間統(tǒng)計(jì)分析采用雙尾未配對(duì)學(xué)生t檢驗(yàn);P≤0.05表示組間顯著性差異。

2 結(jié) 果

2.1 ASFV感染宿主差異基因分析

使用數(shù)據(jù)集GSE145954,對(duì)ASFV強(qiáng)毒株P(guān)ig/Heilongjiang/2018 (Pig/HLJ/18)感染豬外周血單核巨噬細(xì)胞不同時(shí)相點(diǎn)的差異基因進(jìn)行分析,篩選出757個(gè)共同的差異基因(圖1A)。結(jié)合之前報(bào)道的強(qiáng)毒株Georgia 2007/1(GRG)感染全血轉(zhuǎn)錄組差異基因進(jìn)行維恩分析[13],結(jié)果顯示,在高致病的ASFV感染細(xì)胞模型和動(dòng)物模型中,共有差異基因36個(gè)(圖1B)。僅有10個(gè)基因在ASFV感染細(xì)胞模型和動(dòng)物模型中表達(dá)一致,其中ECE1、CCL2、CTSB、SCARB2和CD14在ASFV感染單核巨噬細(xì)胞和動(dòng)物全血中均明顯上調(diào),HMBS、DYNLL1、UBB、EZH2和SERPINE1則明顯下調(diào)(圖1C和D)。

A. ASFV (Pig/HLJ/18)感染豬肺泡巨噬細(xì)胞(PAMs)不同時(shí)間點(diǎn)DEGs維恩圖;B.ASFV (Pig/HLJ/18)感染PAMs和ASFV(Georgia 2007/1)感染豬全血DEGs維恩圖;C.ASFV(Pig/HLJ/18)感染豬肺泡巨噬細(xì)胞和ASFV(Georgia 2007/1)感染豬全血的共同差異基因的相對(duì)表達(dá)量熱圖;D.基因在GSE145954數(shù)據(jù)集中的表達(dá)情況。結(jié)果以表示 (n=3),星號(hào)表示顯著差異(t-test,**.P<0.01)。掃描文章首頁(yè)OSID碼可查看彩圖A. Venn diagram of DEGs in pig alveolar macrophages (PAMs) infected by ASFV (Pig/HLJ/18) at different time points; B. Venn diagram of DEGs in ASFV (Pig/HLJ/18) infected PAMs and ASFV (Georgia 2007/1) infected pig whole blood; C. Heatmap of common differential genes of ASFV (Pig/HLJ/18) infected pig alveolar macrophages and ASFV (Georgia 2007/1) infected pig whole blood; D. Gene expression in GSE145954 dataset. Data represent the (n=3). Asterisks indicate significant differences (t-test, **. P<0.01).The color pictures can be found by scanning the OSID code on the front page of the article圖1 ASFV感染后宿主關(guān)鍵差異表達(dá)基因篩選Fig.1 Screening of key differentially expressed genes in host during ASFV infection

2.2 ASFV感染宿主差異表達(dá)基因GO富集通路分析

采用維恩圖分析上述強(qiáng)毒株感染所引起的宿主差異表達(dá)基因與報(bào)道的弱毒株OURT88/3感染的宿主差異表達(dá)基因(圖2A),結(jié)果顯示,只有CTSB在強(qiáng)毒株和弱毒株感染后具有差異表達(dá),然而CTSB在強(qiáng)毒株感染宿主后表達(dá)上調(diào),在弱毒株感染后表達(dá)下調(diào)(圖1C和圖2B)。這表明利用數(shù)據(jù)挖掘所篩選出來(lái)的ECE1、CCL2、SCARB2、CD14、UBB、HMBS、DYNLL1、EZH2、SERPINE1和CTSB均同ASFV致病相關(guān)。進(jìn)一步使用Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)這些基因生物學(xué)過(guò)程的富集分析顯示(圖2C),這些基因大多集中在正向調(diào)控內(nèi)吞作用(GO: 0045807)以及TLRs信號(hào)通路(GO: 000224)生物學(xué)進(jìn)程。其中CD14、CCL2、SCARB2可正向調(diào)控內(nèi)吞作用,這些宿主分子在ASFV感染后上調(diào)。UBB、SERPINE1和DYNLL1則參與了TLRs信號(hào)通路生物學(xué)進(jìn)程,在ASFV感染后下調(diào)。CTSB它既能激活NLRP3炎癥小體,參與免疫響應(yīng),又與內(nèi)吞途徑相關(guān),在病毒感染中具有重要作用,其上調(diào)表達(dá)加強(qiáng)了多種病毒感染。以上結(jié)果說(shuō)明ECE1、CCL2、SCARB2、CD14、UBB、HMBS、DYNLL1、EZH2、SERPINE1和CTSB同非洲豬瘟病毒強(qiáng)毒株的致病性密切相關(guān)。

A.強(qiáng)毒株感染和弱毒株OURT88/3感染豬DEGS維恩圖;B. CTSB基因在強(qiáng)、弱毒株中感染豬和未感染豬全血的表達(dá)量分析;C.宿主差異基因生物學(xué)過(guò)程富集分析。OURT. 弱毒株OURT88/3; GRG. 強(qiáng)毒株Georgia 2007/1A. Venn diagram of the DEGs in the strong virulent strain and the attenuated strain OUT88/3 infected pig; B. Analysis of CTSB gene expression in whole blood of infected and uninfected pigs in strong and weak virus strains; C. Enrichment analysis of biological processes of DEGs. OURT represents the attenuated strain OURT88/3, GRG represents the virulent strain Georgia 2007/1圖2 ASFV強(qiáng)毒株和低毒株感染宿主差異表達(dá)基因比較Fig.2 Comparison of differentially expressed genes in host during strong and low virulent ASFV strains infection

2.3 ASFV感染宿主差異表達(dá)基因關(guān)鍵基因篩選

利用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)所獲得的36個(gè)差異基因進(jìn)行蛋白質(zhì)相互作用分析,結(jié)果顯示TNF、UBB、TLR2和HSP90AA1可能是宿主抗病毒的關(guān)鍵基因(圖3)。在細(xì)胞水平和動(dòng)物水平的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析中,僅有UBB具有相同的表達(dá)趨勢(shì)。因此認(rèn)為UBB是非洲豬瘟病毒感染的核心宿主基因。另外具有相同的表達(dá)趨勢(shì)的CCL2、CTSB、EZH2、SERPINE1、CD14和DYNLL1同為病毒感染宿主調(diào)控網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵基因。

蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)的樞紐基因,按degree值進(jìn)行排序,顏色越深代表值越大。掃描文章首頁(yè)OSID碼可查看彩圖The hub genes predicted by the protein interaction network are sorted according to the degree value. The darker the color is, the greater the value is.The color picture can be found by scanning the OSID code on the front page of the article圖3 ASFV強(qiáng)毒株感染宿主關(guān)鍵基因篩選Fig.3 Screening of hub gene in host cells during strong virulent ASFV strain infection

2.4 非洲豬瘟病毒關(guān)鍵毒力基因的篩選

進(jìn)一步分析ASFV強(qiáng)毒株Georgia 2007/1(GRG)和弱毒株OURT88/3(OURT)編碼病毒功能蛋白的基因與多基因家族基因發(fā)現(xiàn),EP153R、EP402R、M1249L、B119L、B169L、B407L、CP204L、CP312R和I215L在強(qiáng)毒株和弱毒株中均編碼了有功能的病毒蛋白,但其氨基酸序列具有很大的差異。另外,ASFV強(qiáng)毒株Georgia 2007/1(GRG)編碼了多基因家族蛋白MGF110-12L、MGF360-6L、MGF360-10L、MGF360-11L、MGF360-12L、MGF360-13L、MGF360-14L、MGF505-1R和MGF505-6R,而這些基因在弱毒株OURT88/3缺失。表明這些分子可能是非洲豬瘟病毒感染關(guān)鍵的毒力基因。為篩選出非洲豬瘟病毒編碼的關(guān)鍵致病基因,本文將這些病毒蛋白在3D4/21豬肺泡巨噬細(xì)胞中表達(dá),并檢測(cè)這些蛋白對(duì)前期篩選出的非洲豬瘟病毒感染核心宿主基因UBB的調(diào)控作用。結(jié)果顯示,與對(duì)照組PcDNA3.1及弱毒株OURT比較,強(qiáng)毒株GRG的病毒功能蛋白編碼基因B119L、I215L均能顯著抑制宿主UBB的表達(dá)(圖4A)。與對(duì)照組pcDNA3.1相比,強(qiáng)毒株GRG多基因家族僅MGF360-13L顯著調(diào)控UBB的表達(dá),其它多基因家族基因?qū)BB的調(diào)控?zé)o顯著差異或者促進(jìn)其表達(dá)(圖4B)。因此認(rèn)為強(qiáng)毒株中的B119L、I215L以及MGF360-13L為非洲豬瘟病毒重要的致病基因,并與UBB下調(diào)相關(guān)。

A.抑制3D4/21 細(xì)胞中UBB表達(dá)的非洲豬瘟病毒功能蛋白的篩選;B.強(qiáng)毒株多基因家族對(duì)UBB表達(dá)調(diào)控分析。OURT. 弱毒株OURT88/3; GRG. 強(qiáng)毒株Georgia 2007/1。GADPH為內(nèi)參,結(jié)果以表示 (n=3)。星號(hào)表示顯著差異(t-test,*.P<0.05, **.P<0.01)A. Screening of ASFV genes that inhibited UBB expression by comparing high or low virulent ASFV genes that expression in 3D4/21 cells; B. Analysis of the regulation of UBB expression by high strain polygene family. OURT represents the attenuated strain OURT88/3, GRG represents the virulent strain Georgia 2007/1. GADPH is an internal parameter, and the result is expressed in Data represent the (n=3). Asterisks indicate significant differences t-test,*.P<0.05, **.P<0.01)圖4 抑制UBB表達(dá)的非洲豬瘟病毒蛋白篩選Fig.4 Screening of ASFV protein which repress UBB expression

3 討 論

ASFV感染與宿主之間互作所引起的保護(hù)性免疫機(jī)制尚不清楚,嚴(yán)重制約了非洲豬瘟疫苗的研發(fā)。本文利用公共資源平臺(tái)的生物醫(yī)學(xué)大數(shù)據(jù)挖掘,發(fā)現(xiàn)UBB在非洲豬瘟病毒感染過(guò)程中占據(jù)了核心的地位。無(wú)論是在ASFV感染細(xì)胞模型中,還是在ASFV致病株感染的動(dòng)物模型中,UBB的表達(dá)量均明顯下調(diào),PPI互作網(wǎng)絡(luò)顯示UBB是病毒感染調(diào)控的核心基因(圖1和圖3)。有研究也發(fā)現(xiàn)UBB和病毒轉(zhuǎn)錄本以相反的速率積累[14],說(shuō)明UBB同病毒轉(zhuǎn)錄復(fù)制密切相關(guān)。UBB編碼了一種泛素蛋白,這些泛素蛋白可結(jié)合到底物蛋白質(zhì)分子特定位點(diǎn)上發(fā)生泛素化,與蛋白質(zhì)特異性降解密切相關(guān)。因此宿主UBB的表達(dá)受到抑制,或許同ASFV致病性相關(guān)。

本文進(jìn)一步對(duì)非洲豬瘟病毒強(qiáng)弱毒株編碼的差異蛋白對(duì)ASFV感染宿主的核心基因UBB的調(diào)控作用進(jìn)行了比較,發(fā)現(xiàn)高致病性的強(qiáng)毒株B119L、I215L以及MGF360-13L與宿主UBB表達(dá)受到抑制密切相關(guān)(圖4)。前期已有研究發(fā)現(xiàn)ASFV編碼的I215L基因同宿主E2泛素(UBC)結(jié)合酶同源,在病毒感染期間表達(dá),并在感染后期積累[15-16]。蛋白質(zhì)泛素化修飾主要通過(guò)泛素激活酶E1在ATP供能的情況下黏附在泛素分子尾部,隨后E1將激活的泛素分子轉(zhuǎn)移到泛素結(jié)合酶E2上,此時(shí)E2酶和不同的泛素連接酶E3共同識(shí)別靶蛋白,并對(duì)其進(jìn)行泛素化修飾。因此,I215L編碼的泛素結(jié)合酶可能參與了宿主的蛋白酶泛素化降解途徑,擾亂宿主正常蛋白酶降解系統(tǒng),從而逃逸宿主的免疫監(jiān)視。然而I215L如何去調(diào)控UBB的表達(dá),還需要進(jìn)一步的研究。本文發(fā)現(xiàn)強(qiáng)毒株(Georgia 2007)的B119L也可抑制宿主UBB的表達(dá)。B119L同病毒粒子在巨噬細(xì)胞的成熟和復(fù)制密切相關(guān),該蛋白的缺失可降低病毒毒力[17]。缺失B119L的重組ASFV毒株低劑量注射時(shí),導(dǎo)致病毒在豬體內(nèi)衰減,可誘導(dǎo)對(duì)同源性毒株攻擊的有效保護(hù)[18]。而序列比較顯示,強(qiáng)毒株(Georgia 2007)同弱毒株(OURT88/3)的B119L僅有一個(gè)氨基酸的差異,即強(qiáng)毒株第18位為苯丙氨酸,弱毒株第18位為絲氨酸,該氨基酸的突變或許同病毒調(diào)控宿主泛素化途徑密切相關(guān)。

強(qiáng)毒株和弱毒株基因組最大的差異位于多基因家族(MGFs)區(qū)域,已有研究證明多基因家族MGF360和505/530是非洲豬瘟病毒毒力決定因素,并通過(guò)抑制Ⅰ型IFN的產(chǎn)生發(fā)揮毒力作用[19-20]。例如,MGF360-11L通過(guò)半胱氨酸、泛素-蛋白酶體和自噬途徑降解TBK1和IRF7,抑制Ⅰ型干擾素的表達(dá)[21];MGF360-14L可競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合線粒體抗病毒信號(hào)蛋白(MAVS),抑制TRIM21對(duì)MAVS的泛素化,從而下調(diào)Ⅰ型IFN的產(chǎn)生[22]。這些研究均表明多基因家族通過(guò)調(diào)控宿主泛素化途徑從而抑制宿主的天然免疫反應(yīng)。本文發(fā)現(xiàn),MGF360-13L的表達(dá)會(huì)抑制UBB轉(zhuǎn)錄,說(shuō)明該基因可能同樣參與病毒調(diào)控宿主泛素化的途徑。最近的研究發(fā)現(xiàn)ASFV多基因家族的MGF360-13L能夠抑制細(xì)胞的炎性因子(IL-1β、IL-6和TNF-α等)表達(dá)[23],也可通過(guò)cGAS-STING 信號(hào)通路抑制宿主Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生。本文推測(cè)ASFV的MGF360-13L可能通過(guò)影響宿主體內(nèi)泛素化基因從而調(diào)控宿主Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生,但其如何發(fā)揮作用還需進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

本研究初步篩選獲得了系列參與ASFV感染的宿主調(diào)控網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵基因,包括UBB、CCL2、CTSB、EZH2、SERPINE1、CD14和DYNLL1基因,其中UBB是宿主調(diào)控的核心基因。由于ASFV的B119L、I215L以及MGF360-13L基因都調(diào)控了宿主泛素化信號(hào)通路關(guān)鍵分子UBB,因此本文推測(cè)ASFV的這三個(gè)基因與其免疫逃逸密切相關(guān),是研發(fā)ASF的特效藥和疫苗的關(guān)鍵靶標(biāo)分子。