牛支原體0580基因C端截短體的原核表達(dá)及生物學(xué)功能初步分析

荊婷婷,尹 號(hào),黃 蓉,蘭仕梅,李章程,尤留超,郝華芳,付 磊,儲(chǔ)岳峰

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所,蘭州大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)與生物安全學(xué)院,動(dòng)物疫病防控全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,蘭州 730000)

牛支原體屬于柔膜體綱、支原體屬,是介于細(xì)菌和病毒之間的自然界存在的最小的最簡(jiǎn)單的能進(jìn)行自我復(fù)制的原核微生物。目前已分離鑒定出與牛病相關(guān)的支原體有20多種,牛支原體是其中一種。1961年,美國(guó)人Hale首次從患乳腺炎的病牛中分離到牛支原體,1967年,發(fā)現(xiàn)其與牛呼吸道疾病有關(guān),并被命名為Mycoplasmabovis[1],我國(guó)湖北省于2008年首次暴發(fā)了由牛支原體引起的犢牛“爛肺病”,發(fā)病率高達(dá)50%～100%,死亡率可達(dá)10%～50%,嚴(yán)重?fù)p害了我國(guó)養(yǎng)牛業(yè)的健康發(fā)展[2-3]。更多研究表明牛支原體能引起牛肺炎、乳房炎、關(guān)節(jié)炎、結(jié)膜炎等多種疾病,還可與其他病原一起引起混合感染[4-6],已給全球養(yǎng)牛業(yè)以及乳制品業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失[7-8],開(kāi)展其致病機(jī)制研究及開(kāi)發(fā)防控產(chǎn)品一直是科學(xué)工作者們研究牛支原體的熱點(diǎn)方向。

牛支原體主要通過(guò)黏附宿主組織細(xì)胞來(lái)實(shí)現(xiàn)在機(jī)體中的定殖,進(jìn)而破壞宿主免疫屏障。通過(guò)抑制宿主免疫、釋放毒素物質(zhì)、掠奪宿主營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等途經(jīng)造成宿主損傷[9-13]。此外,在牛支原體膜表面存在著結(jié)構(gòu)和功能的多樣性可變脂蛋白家族(Vsps),有助于牛支原體躲避宿主免疫系統(tǒng)的識(shí)別。除了這些,牛支原體還存在一些毒力因子,如膜蛋白核酸酶,能誘導(dǎo)宿主細(xì)胞的凋亡[14]。早在1968年就有研究表明多種支原體具有溶血毒性,如肺炎支原體、雞毒支原體、豬鼻支原體、綿羊肺炎支原體等[15-18]。孫遠(yuǎn)航等[18]原核表達(dá)了綿羊肺炎支原體Y98株的溶血素(hemolysin)HlyA基因,并證明了該蛋白具有溶血活性。豬鼻支原體通過(guò)同源重組定向缺失技術(shù)確定了與溶血相關(guān)的基因HlyC[20]。

本研究發(fā)現(xiàn)牛支原體模式菌株P(guān)G45以及08M、07801臨床分離株對(duì)鼠紅細(xì)胞有溶解能力,進(jìn)而根據(jù)NCBI上的基因注釋及序列比對(duì)找到假定的可能與溶血素相關(guān)的基因MBOVPG45_0580。通過(guò)對(duì)0580的氨基酸序列以及核苷酸序列進(jìn)行分子特征分析,發(fā)現(xiàn)該蛋白氨基酸序列在牛支原體多種菌株中的保守性極高。通過(guò)原核表達(dá)外源性0580蛋白的C端截短體、制備其多克隆抗體、溶血試驗(yàn)、黏附試驗(yàn)等,初步分析MBOVPG45_0580在牛支原體致病機(jī)制中的生物學(xué)作用。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株、載體及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 大腸桿菌感受態(tài)DH5α、BL21(AI),表達(dá)載體Pcold III,牛支原體PG45、08 M、07801菌株均來(lái)自本實(shí)驗(yàn)室。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為6周齡BALB/c雌性小鼠,由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.1.2 主要試劑材料 氨芐青霉素(100 g·L-1)、IPTG誘導(dǎo)劑、咪唑、TBST、PBST、脫脂奶粉、牛血清蛋白(BSA)、LB培養(yǎng)基(胰蛋白胨10 g·L-1、酵母提取物5 g·L-1、氯化鈉10 g·L-1)、TAE電泳緩沖液(2 mmol·L-1Tris、1 mol·L-1乙酸、100 mmol·L-1EDTA)、SDS電泳緩沖液(0.025 mol·L-1Tris、0.25 mol·L-1Glycine、0.5% SDS)、轉(zhuǎn)膜緩沖液(48 mmol·L-1Tris、39 mmol·L-1Glycine、0.037%甲醇)等購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;HigH Affinity NI-NTA Resin購(gòu)自金斯瑞生物科技公司;蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)、Super Signal West Atto超敏底物購(gòu)自賽默飛爾而科技公司;HIS標(biāo)簽鼠源抗體、HRP標(biāo)記的羊抗鼠抗體購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司;DL 5000/2000 DNA marker、Phanta Super-Fidelity DNA聚合酶等試劑購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司;質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒、T4連接酶、NdeⅠ限制性內(nèi)切酶、XbaⅠ限制性內(nèi)切酶購(gòu)自TaKaRa公司,CFDA SE細(xì)胞增殖與示蹤檢測(cè)試劑盒與DAPI核染料購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司,鬼筆環(huán)肽染料購(gòu)自美國(guó)Cytoskeleton公司。

1.1.3 主要儀器 CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自賽默飛生物科技有限公司,生物安全柜購(gòu)自蘇州安泰公司,PCR儀、垂直電泳系統(tǒng)、凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自Bio-Rad公司,水平核酸電泳系統(tǒng)購(gòu)自北京六一有限公司,激光共聚焦顯微鏡購(gòu)自德國(guó)徠卡公司。

1.2 生物信息學(xué)分析以及同源性分析

以牛支原體PG45菌株基因組DNA為模板,從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)查找PG45菌株0580蛋白的氨基酸序列(GenBank登錄號(hào):WP_013456244.1),將氨基酸序列上傳至在線分析軟件ProParam、ProScale analysis、SignalP 6.0,TMHMM Server 2.0,預(yù)測(cè)蛋白的理化性質(zhì)、分子量大小、跨膜區(qū)等參數(shù)。利用DNAStar軟件對(duì)0580蛋白的氨基酸序列、親疏水區(qū)進(jìn)行分析,篩選主要結(jié)構(gòu)域。從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中收集支原體0580的氨基酸序列,采用MEGA 6.0軟件進(jìn)行氨基酸序列分析,并以此構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。

1.3 引物設(shè)計(jì)以及重組蛋白0580-C原核表達(dá)載體的構(gòu)建

將0580蛋白氨基酸序列交由生工生物工程(上海)股份有限公司按照大腸桿菌偏愛(ài)密碼子進(jìn)行密碼子優(yōu)化并進(jìn)行基因合成,以便更容易在大腸桿菌中進(jìn)行可溶性表達(dá)。通過(guò)Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增0580截短的C端基因的特異性引物,上游引物:0580-C-NdeI-F:5′AAACATATGGGCA-AGATCGGTCGTAATATTTACATCAC 3′;下游引物: 0580-C-His-XbaI-R:5′TTTTCTAGATCA-GTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTTTATC 3′,預(yù)期擴(kuò)增片段長(zhǎng)為894 bp。PCR擴(kuò)增0580-C片段,電泳后進(jìn)行膠回收純化。用限制性內(nèi)切酶NdeⅠ、XbaⅠ分別對(duì)純化產(chǎn)物和Pcold III載體進(jìn)行雙酶切,使用T4連接酶將酶切后的片段與載體過(guò)夜連接,轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)DH5α中,挑取菌落進(jìn)行PCR鑒定,篩選出的陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序。

1.4 重組蛋白0580-C的誘導(dǎo)表達(dá)與純化

取50 ng測(cè)序完全正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入BL21(AI)表達(dá)菌株中,挑取單克隆于帶有100 μg·mL-1氨芐青霉素抗性的3 mL LB培養(yǎng)基中進(jìn)行復(fù)壯后轉(zhuǎn)接,待菌液OD值到達(dá)0.6～0.8時(shí),分別加入至終濃度為0、8、0.8、0.08 mmol·L-1的IPTG誘導(dǎo)劑,于16 ℃,120 r·min-1,誘導(dǎo)30 h。收集菌體,經(jīng)超聲破碎儀破碎后,制備上清液蛋白樣和沉淀蛋白樣。經(jīng)過(guò)SDS-PAGE電泳染色后,觀察蛋白是否表達(dá),上清中蛋白表達(dá)量最多的則為最佳誘導(dǎo)劑濃度。使用最適表達(dá)條件進(jìn)行大量誘導(dǎo)產(chǎn)生蛋白,采用NTA樹(shù)脂進(jìn)行親和層析純化。對(duì)純化后蛋白進(jìn)行超濾濃縮,使用Bradford法測(cè)濃縮后蛋白濃度檢測(cè)濃縮后蛋白濃度。

1.5 重組蛋白0580-C的鑒定

將重組蛋白0580-C(rMbovP0580-C)以10 μL·孔-1上樣,進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳,先用80 V電泳30 min再換成120 V繼續(xù)跑膠1 h。通過(guò)濕式轉(zhuǎn)印法將蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜上,電壓為100 V,時(shí)間為1 h。將PVDF膜使用5% BSA在室溫條件下封閉2 h后,使用商品化的鼠源一抗(HIS)按照1∶5 000稀釋,室溫孵育1 h,使用TBST洗滌3次,10 min一次。再用HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG二抗按照1∶5 000稀釋,孵育1 h后洗滌,使用ECL進(jìn)行顯色。

1.6 多克隆抗體的制備與效價(jià)測(cè)定

在免疫前,對(duì)5只6周齡BALB/c雌性小鼠進(jìn)行尾靜脈采血,制備血清。首次免疫時(shí),將純化的蛋白與完全弗氏佐劑等體積充分混合形成油包水乳化劑,皮下多點(diǎn)注射進(jìn)行免疫,免疫劑量為100 μg·只-1。之后第14、21、28、35天分別進(jìn)行免疫,使用不完全弗氏佐劑與純化的蛋白等體積混合,免疫劑量不變。最后兩次免疫采用腹腔注射。第五次免疫一周后對(duì)小鼠進(jìn)行眼眶靜脈叢采血,分離血清,所得即為針對(duì)0580-C重組蛋白的鼠源多克隆抗體。

取12.5 μg純化后的重組蛋白0580-C作為抗原進(jìn)行包被,于4 ℃過(guò)夜孵育后,使用5%脫脂奶粉(0.137 mol·L-1NaCl,0.02 mol·L-1Tris,50 g·L-1脫脂奶粉)37 ℃封閉2 h。使用PBST洗滌3次,每孔300 μL,每次3 min。將獲取的陽(yáng)性以及陰性血清使用PBST從1∶800開(kāi)始二倍比稀釋進(jìn)行孵育,每孔100 μL,37 ℃孵育1 h,洗滌后使用HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG(稀釋倍數(shù)為1∶10 000)100 μL·孔-1再次孵育1 h。孵育結(jié)束后進(jìn)行洗滌,使用顯色液、終止液進(jìn)行顯色。最后用酶標(biāo)測(cè)定儀在450 nm 處讀取OD值。待測(cè)血清OD450 nm的數(shù)值記為S,陰性對(duì)照血清測(cè)定的OD450 nm數(shù)值記為N,S/N≥2.1即為陽(yáng)性,以能獲得陽(yáng)性的最大稀釋比例作為待檢血清的抗體效價(jià)[21]。

1.7 重組蛋白0580-C的免疫印跡檢測(cè)

將rMbovP0580-C以10 μL·孔-1上樣,進(jìn)行SDS電泳后轉(zhuǎn)印到PVDF膜上,加入含有5% BSA的封閉液進(jìn)行孵育;rMbovP0580-C的鼠源多克隆抗體按1∶3 000稀釋后作為一抗,于搖床上(100 r·min-1)室溫孵育1 h,使用TBST洗滌后再用HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG二抗按照1∶10 000稀釋,孵育1 h后洗滌,使用ECL進(jìn)行顯色。

1.8 重組蛋白0580-C內(nèi)源性表達(dá)鑒定

以1∶9的比例復(fù)蘇牛支原體PG45、08 M、07801菌株,再轉(zhuǎn)接至200 mL MTB培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)72～84 h,集菌破碎后制備蛋白樣,以10 μL·孔-1上樣,進(jìn)行SDS電泳,轉(zhuǎn)印。加入含有5% BSA的封閉液進(jìn)行孵育;將制備的rMbovP0580-C鼠源多抗按照1∶1 000稀釋后作為一抗孵育1 h,洗滌后再用HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG二抗按照1∶10 000稀釋,孵育1 h后洗滌,使用ECL進(jìn)行顯色。

1.9 重組蛋白0580-C的溶血性試驗(yàn)

將200、400 μg純化超濾后的rMbovP0580-C分別與等體積的2%鼠紅細(xì)胞懸液混合,于37 ℃溫箱中孵育3 h,觀察是否有溶血現(xiàn)象發(fā)生。

1.10 重組蛋白0580-C對(duì)PG45菌株黏附EBL細(xì)胞能力的影響

參考Zou等[22]、Zhu等[23]的研究方法設(shè)計(jì)蛋白對(duì)牛支原體黏附力影響的試驗(yàn),并進(jìn)行優(yōu)化。

1.10.1 菌落計(jì)數(shù)法

1.10.1.1 支原體及細(xì)胞準(zhǔn)備:將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的牛支原體以12 000 r·min-1離心10 min,使用PBS洗滌3次后采用DMEM(無(wú)抗含血清)重懸,進(jìn)行計(jì)數(shù)。將胎牛肺細(xì)胞(EBL)鋪于12孔板中,待其生長(zhǎng)至每孔約80%時(shí),以DMEM(無(wú)抗無(wú)血清)洗滌3次并隨機(jī)選取一孔使用胰酶消化計(jì)數(shù)。其余孔洗滌后加入細(xì)胞培養(yǎng)基。

1.10.1.2 細(xì)胞感染:感染量為每個(gè)細(xì)胞接種100個(gè)支原體,在陰性對(duì)照組加入400 μg BSA蛋白,試驗(yàn)組加入400 μg rMbovP0580-C,使用DMEM(無(wú)抗含血清)將每孔加液量補(bǔ)至1 mL,混勻后放到含5% CO2的37 ℃溫箱中感染EBL細(xì)胞1.5 h。

1.10.1.3 計(jì)數(shù):感染結(jié)束后,使用預(yù)熱的PBS洗去未黏附的牛支原體,加入胰酶消化細(xì)胞,用細(xì)胞培養(yǎng)基終止消化并充分吹打細(xì)胞。取100 μL加入到900 μL PBS中,進(jìn)行梯度稀釋,取10-3、10-4稀釋度懸液各100 μL涂布牛支原體固體培養(yǎng)基,置于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)3～5 d后對(duì)菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)。

試驗(yàn)設(shè)置牛支原體PG45感染組(空白組)、PG45+BSA蛋白(陰性)組、PG45+ rMbovP0580-C(試驗(yàn))組。每組設(shè)2個(gè)重復(fù),試驗(yàn)平行重復(fù)3次,計(jì)算黏附率(%)=(試驗(yàn)組CFU÷輸入PG45 CFU)×100%。

1.10.2 激光共聚焦顯微鏡觀察法 按照CEDA SE試劑的說(shuō)明書對(duì)牛支原體進(jìn)行染色后,按照菌落計(jì)數(shù)法中所述進(jìn)行細(xì)胞感染試驗(yàn),其中rMbovP0580-C、BSA蛋白質(zhì)用量為100 μg。感染結(jié)束后洗滌細(xì)胞,加入500 μL 4%多聚甲醛室溫靜置固定30 min。固定后加入300 μL 0.5% Triton 100,室溫透化細(xì)胞10～15 min;洗滌后避光加入300 μL 鬼筆環(huán)肽對(duì)細(xì)胞骨架進(jìn)行染色處理,室溫反應(yīng)20 min。洗滌后,避光加入300 μL DAPI細(xì)胞核染藍(lán)色熒光染料,37 ℃反應(yīng)20 min。洗滌干凈后進(jìn)行封片處理,于徠卡激光共聚焦顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.11 重組蛋白0580-C蛋白的多克隆抗體對(duì)PG45菌株黏附EBL細(xì)胞能力的影響

參考張懿[24]、Song等[25]試驗(yàn)方法設(shè)計(jì)并優(yōu)化rMbovP0580-C的多抗對(duì)PG45黏附能力的影響試驗(yàn)。

1.11.1 菌落計(jì)數(shù)法 將針對(duì)rMbovP0580-C的鼠源多克隆抗體、鼠源陰性血清于56 ℃水浴鍋中滅活30 min,將支原體與已滅活的血清按照1∶10的比例充分混合,放到含5% CO2的37 ℃溫箱內(nèi)共孵育1 h。向細(xì)胞中加入與血清共孵育后的PG45,使用DMEM(無(wú)抗含血清)將每孔加液量補(bǔ)至1 mL,于37 ℃溫箱感染EBL細(xì)胞1.5 h。感染結(jié)束后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行洗滌、消化以及稀釋涂板計(jì)數(shù)。

試驗(yàn)設(shè)置PG45(對(duì)照)組、PG45+免疫前血清(陰性)組和PG45+rMbovP0580-C多克隆抗體1∶10。每組設(shè)置2個(gè)重復(fù),試驗(yàn)平行重復(fù)3次,計(jì)算黏附率(%) =(試驗(yàn)組CFU÷輸入PG45 CFU)×100%。

1.11.2 激光共聚焦顯微鏡觀察法 將支原體染色后與多抗血清按照1∶10的比例共孵育1 h,再感染EBL細(xì)胞1.5 h。按照“1.10”所述操作步驟對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定、透化以及染色處理,于徠卡激光共聚焦顯微鏡下進(jìn)行觀察。

2 結(jié) 果

2.1 生物信息學(xué)分析以及同源性分析

PG45菌株的0580基因全長(zhǎng)大小為1 293 bp,該基因編碼430個(gè)氨基酸,預(yù)測(cè)的0580蛋白分子量約為49 ku,等電點(diǎn)為5.99,不穩(wěn)定系數(shù)為39.03,是一種穩(wěn)定的親水性蛋白(圖1A)。經(jīng)TMHMM Server v2.0、SMART Model和SignalP 6.0 Sever預(yù)測(cè),該蛋白含有4個(gè)跨膜區(qū),N端的1—28氨基酸序列預(yù)測(cè)為信號(hào)肽區(qū)域(圖1B),C端蛋白截短體含有289個(gè)氨基酸,大小約為37 ku,存在兩個(gè)CBS結(jié)構(gòu)域(圖1C),CBS編碼胱硫醚-β-合成酶,參與同型半胱氨酸的轉(zhuǎn)硫途經(jīng)。通過(guò)Blastp將0580蛋白序列比對(duì)nr數(shù)據(jù)庫(kù),用MEGA 5.0軟件進(jìn)行序列比對(duì)分析并構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)(圖1D)。如圖所示,0580蛋白氨基酸序列非常保守,在08M、CQ-W70、HB-0801、PG45這些菌株中0580相似性為100%;同樣與無(wú)乳支原體、與豬鼻支原體、綿羊肺炎支原體、豬肺炎支原體相似性較高。

A. 0580蛋白親/疏水性預(yù)測(cè);B. 0580蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè);C. 0580蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè);D. 基于0580氨基酸序列構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)A. Hydrophilicity and hydrophobicity prediction of 0580 protein; B. Signal peptide prediction of 0580 protein; C. Transmembrane domain prediction of 0580 protein; D. Phylogenetic tree based on 0580 amino acid sequences圖1 rMbovP0580-C生物信息學(xué)分析Fig.1 Bioinformatics analysis of the 0580 protein

2.2 rMbovP0580-C原核表達(dá)載體構(gòu)建

使用引物對(duì)0580-C基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增,片段大小為894 bp(圖2A),符合預(yù)期大小。將0580-C基因片段連接到Pcold III載體上,通過(guò)PCR鑒定與測(cè)序比對(duì),成功構(gòu)建0580-C原核表達(dá)載體(圖2B)。

A. 0580-C基因片段擴(kuò)增;B. PCR鑒定單菌落;M. DL5000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1～2. 0580-C基因擴(kuò)增片段;3. H2O;4～7. 陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子A. PCR amplification result of 0580-C gene; B. Identified the clony by PCR; M. DL5000 DNA marker; 1-2. 0580-C gene; 3. H2O; 4-7. Positive transformation 圖2 0580-C基因擴(kuò)增及重組質(zhì)粒的構(gòu)建Fig.2 Amplification of 0580-C gene and construction of recombinant plasmid

2.3 rMbovP0580-C的誘導(dǎo)表達(dá)與純化

經(jīng)SDS電泳分析,rMbovP0580-C在IPTG濃度為8、0.8、0.08 mmol·L-1時(shí)均進(jìn)行表達(dá)(圖3A)。選取0.8 mmol·L-1IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)、純化,蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量約為37 ku,符合預(yù)測(cè)值(圖3B)。

A. 在不同IPTG濃度下rMbovP0580-C的表達(dá);B. rMbovP0580-C的純化;M. 蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); 1、3、5、7. IPTG濃度分別為0、8、0.8、0.08 mmol·L-1時(shí)的誘導(dǎo)表達(dá)破碎后的上清蛋白;2、4、6、8. IPTG濃度分別為0、8、0.8、0.08 mmol·L-1時(shí)的誘導(dǎo)表達(dá)破碎后的沉淀;9～10.空載質(zhì)粒對(duì)照; 11.菌體裂解后上清液;12.過(guò)柱液;13～18.咪唑濃度分別為12.5、50、100、200、300、1 000 mmol·L-1的洗脫液A. Expression of recombinant 0580-C protein under different concentrations of IPTG; B. purified the recombinant 0580-C protein;M. Protein marker; 1, 3, 5, 7. Supernatant of protein was induced by 0, 8, 0.8, 0.08 mmol·L-1 IPTG; 2, 4, 6, 8. Precipitation of protein was induced by 0, 8, 0.8, 0.08 mmol·L-1 IPTG; 9-10.Control; 11. Supernatant; 12. Effluent; 13-18. Eluent of 12.5, 50, 100, 200, 300, 1 000 mmol·L-1 imidazole圖3 rMbovP0580-C的表達(dá)與純化Fig.3 Expression and purification of rMbovP0580-C

2.4 rMbovP0580-C的外源性及內(nèi)源性表達(dá)鑒定、免疫印跡檢測(cè)與效價(jià)測(cè)定

以小鼠抗His單抗為一抗、HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG抗體為二抗,進(jìn)行SDS PAGE及Western blot分析,在37 ku附近產(chǎn)生特異性反應(yīng)條帶(圖4A、B),成功表達(dá)重組蛋白0580-C。

A. SDS PAGE檢測(cè)rMbovP0580-C蛋白的表達(dá);B. Western blot檢測(cè)rMbovP0580-C蛋白的表達(dá);C. rMbovP0580-C多克隆抗體檢測(cè)內(nèi)源性表達(dá)表達(dá)的0580蛋白;D. rMbovP0580-C多克隆抗體檢測(cè)重組表達(dá)的rMbovP0580-C蛋白;M. 蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn);1. 純化的rMbovP0580-C蛋白;2～4. 08M、07801、PG45上清液; C.對(duì)照蛋白A. Detection the expression of rMbovP0580-C protein by SDS PAGE; B. Detection the expression of rMbovP0580-C by Western blot; C. rMbovP0580-C polyclonal antibody was used to detect the endogenous expression of rMbovP0580-C protein; D. rMbovP0580-C polyclonal antibody was used to detect the recombinant rMbovP0580-C protein; M. Protein marker; 1. rMbovP0580-C purified protein; 2-4. Supernatant of 08M, 07801, PG45; C. Control protein圖4 rMbovP0580-C 蛋白的鑒定與多克隆抗體的特異性檢測(cè)Fig.4 Identification of rMbovP0580-C protein and detection of specificity of polyclonal antibody

為檢測(cè)針對(duì)rMbovP0580-C產(chǎn)生的多克隆抗體的特異性,使用多抗檢測(cè)牛支原體不同菌株。Western blot結(jié)果顯示:鼠源 rMbovP0580-C多克隆抗體能夠檢測(cè)出牛支原體PG45、08M、07801菌株中的天然0580蛋白,條帶在60 ku附近,大于預(yù)測(cè)大小(圖4C)。

將制備的鼠源rMbovP0580-C的多克隆抗體與rMbovP0580-C進(jìn)行Western blot反應(yīng),出現(xiàn)特異性條帶(圖4D)。

取12.5 μg rMbovP0580-C蛋白作為抗原包被,鼠源rMbovP0580-C多克隆抗體血清作為抗體,進(jìn)行間接免疫ELISA試驗(yàn),結(jié)果顯示:鼠源rMbovP0580-C的多克隆抗體效價(jià)達(dá)1∶204 800(圖5A),表明rMbovP0580-C蛋白免疫原性良好。

A. rMbovP0580-C多克隆抗體效價(jià)測(cè)定;B.鼠紅細(xì)胞溶血性試驗(yàn);C. rMbovP0580-C蛋白對(duì)PG45菌株黏附EBL能力的影響;D. rMbovP0580-C多克隆抗體對(duì)PG45菌株黏附EBL能力的影響A. Titer detection of rMbovP0580-Cpolyclonal antibody; B. Hemolytic test of mouse red blood cells; C. Effect of rMbovP0580-C protein on PG45 strain adhesion of EBL cell; D. Effect of rMbovP0580-C polyclonal antibody on PG45 strain adhesion of EBL cell圖5 rMbovP0580-C多抗效價(jià)的測(cè)定及rMbovP0580-C蛋白生物學(xué)功能初步分析Fig.5 Titer detection of rMbovP0580-Cpolyclonal antibody and preliminarily analyse biological function of rMbovP0580-C protein

2.5 rMbovP0580-C生物學(xué)功能初步分析

將0580-C蛋白與鼠紅細(xì)胞37 ℃共孵育后發(fā)現(xiàn),rMbovP0580-C蛋白不具有溶解鼠紅細(xì)胞的能力(圖5B)。但是通過(guò)分析細(xì)胞黏附及黏附阻斷試驗(yàn)的結(jié)果發(fā)現(xiàn),加入 rMbovP0580-C蛋白后,牛支原體PG45菌株對(duì)EBL細(xì)胞的黏附作用增強(qiáng)(圖5C);而加入 rMbovP0580-C抗血清后,PG45菌株對(duì)EBL細(xì)胞的黏附能力下降(圖5D)。激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果顯示,當(dāng)加入rMbovP0580-C重組蛋白后,細(xì)胞周圍的綠色熒光數(shù)量增多,即黏附的支原體增多;而將牛支原體與rMbovP0580-C的多抗血清孵育后再感染細(xì)胞,細(xì)胞周圍的綠色熒光減少,即多抗血清對(duì)牛支原體對(duì)EBL細(xì)胞的黏附有抑制作用(圖6B)。

圖6 rMbovP0580-C細(xì)胞黏附及黏附阻斷試驗(yàn)Fig.6 Cell adhesion and blocking of rMbovP0580-C

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)牛支原體能夠使鼠紅細(xì)胞溶血,通過(guò)基因注釋找到了假定的與溶血素相關(guān)的基因序列MBOVPG45_0580,嘗試對(duì)其進(jìn)行全長(zhǎng)表達(dá)。由于該基因編碼的蛋白具有4個(gè)跨膜區(qū),在溫度、誘導(dǎo)劑濃度、搖床振蕩速度等條件的優(yōu)化下,更換Pcold載體、PET28a載體、PGEX載體均無(wú)法表達(dá)0580基因編碼的全長(zhǎng)蛋白。作者對(duì)該蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)在其C端具有兩個(gè)CBS結(jié)構(gòu)域,CBS (cystathionine-β-synthase)是編碼胱硫醚-β-合成酶的基因,參與半胱氨酸的代謝途經(jīng)。綿羊肺炎支原體溶血素TlyC基因也含有CBS結(jié)構(gòu)域[26],在加入半胱氨酸時(shí),穿透支原體對(duì)羊紅細(xì)胞溶血作用提高了10倍,表明穿透支原體的溶血素可能含有半胱氨酸殘基[16]。因而作者對(duì)含有CBS區(qū)的0580-C端截短體進(jìn)行原核表達(dá),純化后的 rMbovP0580-C蛋白免疫小鼠后能得到高效價(jià)的抗體,免疫原性良好,但截短后外源表達(dá)的rMbovP0580-C并不具有溶血功能。黏附是牛支原體侵襲宿主組織的第一步[27],目前,已報(bào)道的與牛支原體黏附作用有關(guān)的蛋白有16種[28],如α-enolase[25]、TrmFO[29]、FBA[30]、P27[32]、P48[32]、NADH[33]和NOX2[34]等。本研究中的細(xì)胞黏附以及黏附阻斷試驗(yàn)結(jié)果顯示:0580-C蛋白可促進(jìn)牛支原體對(duì)EBL細(xì)胞的黏附,而其多克隆抗體有黏附抑制作用,故推測(cè)0580基因編碼的蛋白可能在PG45對(duì)宿主的黏附過(guò)程中發(fā)揮促進(jìn)作用,進(jìn)而助于感染宿主細(xì)胞。在本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的牛支原體突變體庫(kù)中未篩選到假定的與溶血素相關(guān)的突變株,因此無(wú)法對(duì)該基因進(jìn)行深層次的機(jī)制探究?；谂Ｖгw的定點(diǎn)突變的遺傳操作工具的缺乏,制約了人們對(duì)牛支原體基因功能的探索,希冀學(xué)者在此方面有更進(jìn)一步的研究。

4 結(jié) 論

成功地原核表達(dá)出牛支原體0580基因編碼的假定與溶血素相關(guān)的蛋白C端截短體,盡管rMbovP0580-C蛋白不能使鼠紅細(xì)胞溶血,但能促進(jìn)PG45菌株對(duì)胎牛肺細(xì)胞的黏附能力,表明rMbovP0580-C蛋白可能是牛支原體的一種黏附分子,這為深入研究假定溶血素蛋白的生物學(xué)功能及牛支原體致病機(jī)制提供了研究基礎(chǔ)。