谷氨酰胺對BCG誘導小鼠傳代巨噬細胞凋亡的調控作用

安 琪,于嘉霖,吳曉玲,鄧光存*

(1.西部特色生物資源保護與利用教育部重點實驗室(寧夏大學),銀川 750021;2.寧夏大學生命科學學院,銀川 750021)

結核病(tuberculosis,TB)是由結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis,Mtb)感染所致的一種發病率與致死率均較高的人畜共患傳染病[1]。據世界衛生組織報道,2020年,全球新增人結核病例約1 000萬,死亡病例約140萬,而且多重耐藥性使結核病預防及治療更加困難[2-3]。因此,了解Mtb感染的宿主反應對開發結核病新的治療方法至關重要。巨噬細胞作為Mtb主要的宿主細胞和靶細胞,受到感染后會通過分泌炎性因子,啟動自噬、凋亡等程序清除病原菌,但隨著Mtb的不斷增殖,巨噬細胞也會發生壞死并導致Mtb逃逸進而感染其他細胞[4-6]。其中,巨噬細胞凋亡作為抵抗Mtb感染的重要機制之一,在感染早期可以通過凋亡來清除胞內的Mtb,并通過加工、遞呈抗原激活其他的免疫細胞,進一步增強機體的免疫應答反應[7]。因此,探究Mtb與細胞凋亡之間的博弈過程及選擇性誘導細胞凋亡是抗Mtb感染的研究重點。

在Mtb感染的過程中,宿主的免疫應答受到表觀遺傳、代謝等多種因素的調控,這些調控機制提高了宿主抵抗Mtb的效率,也避免了因過度炎癥反應而導致的組織損傷[8-10]。谷氨酰胺作為血液和肌肉中含量最豐富的循環氨基酸,在巨噬細胞的代謝過程中發揮著重要作用[11]。谷氨酰胺的分解代謝可以激活巨噬細胞代謝重編程,與細胞糖酵解相互協調共同提供M1型巨噬細胞的生物能量和生物合成前體,且谷氨酰胺分解后產生的脯氨酸和α-酮戊二酸(α-KG)也可以用于補充TCA循環、激活mTORC1、脯氨酸羥基化和表觀遺傳調控[12-13]。最新研究發現,谷氨酰胺可以通過促進組蛋白甲基化影響IPF成纖維細胞中抗凋亡基因的表達[13]。同時,在TRAIL參與誘導的MDA-MB-231細胞凋亡中,剝奪谷氨酰胺上調了ATF4和磷酸化eIF2α的表達,通過內質網應激促進了細胞凋亡的發生[14]。此外,谷氨酰胺也能促進腸上皮細胞的增殖,調控緊密連接蛋白,對正常及病理情況下細胞凋亡及細胞應激具有保護作用。但是,目前在結核分枝桿菌感染過程中,谷氨酰胺的代謝及其與宿主細胞凋亡的關系尚未闡明[15-16]。因此,本研究擬采用BCG感染巨噬細胞誘導凋亡,探究BCG感染的細胞內谷氨酰胺代謝的變化,利用無谷氨酰胺培養基構建谷氨酰胺剝奪模型,研究谷氨酰胺代謝對BCG誘導的巨噬細胞RAW264.7凋亡的調控作用,以期為結核病的發病機制研究提供新的依據。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

DMEM培養基、無谷氨酰胺培養基購于Gibco公司;小牛血清及胎牛血清購于BI公司;5×SDS-PAGE電泳緩沖液購于上海百賽生物技術公司;β-actin、Caspase 3、PARP、SLC1A5、GLS、GLUD單克隆抗體、熒光二抗均購自Proteintech公司;全蛋白提取試劑盒、細胞凋亡檢測試劑盒均購自凱基生物;CCK 8試劑盒購于ApexBio;谷氨酰胺、谷氨酸、α酮戊二酸、谷胱甘肽ELISA檢測試劑盒均購于晶美生物。

蛋白電泳裝置、酶標儀、全自動細胞計數儀(美國,Bio-Rad公司);高速冷凍離心機(日本,日立公司);微量移液器、高速離心機(德國,Eppendofr);GE化學發光檢測儀(美國,General Electric Company)。

1.2 細胞與菌株

小鼠RAW264.7細胞株來自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫;牛結核分枝桿菌疫苗株(Bacillus Calmette-Guerin,BCG)購于上海生物制品研究所。

1.3 BCG培養

選擇Middlebrook7 H10固體培養基復蘇BCG菌株,接著將復蘇后的BCG接種到Middlebrook7 H9液體培養基中,最后將Middlebrook7 H9液體培養基放置在恒溫培養箱中培養(37 ℃、50 mL·L-1CO2),期間每三周進行一次傳代培養。

1.4 細胞培養

RAW264.7細胞培養采用含有10 mL·L-1胎牛血清的DMEM培養基,當細胞密集貼壁生長后,棄去培養液,用2 mL PBS沖洗2遍,然后加入2 mL胰酶消化2 min,1 000 r·min-1離心5 min,棄去培養液后,加入2 mL培養基重懸細胞,根據細胞數量在培養皿內分配細胞懸液并靜置于37 ℃、50 mL·L-1CO2的恒溫培養箱中。

1.5 免疫印跡

將細胞按1×106·孔-1接種在六孔板中,按照試驗設計對細胞進行處理,根據全蛋白提取試劑盒的說明書進行蛋白提取,再經BCA對蛋白進行定量,最后選用適當濃度的SDS-PAGE膠進行電泳,電泳完成后選用300 mA轉膜2 h,SuPerblock 37 ℃恒溫搖床封閉1 h,4 ℃過夜孵育一抗(一抗1∶1 000稀釋,β-actin作為內參1∶5 000稀釋),再用TBST緩沖液清洗30 min(5 min·次-1),二抗(1∶5 000稀釋)在室溫孵育2 h,然后用TBST緩沖液沖洗30 min(6 min·次-1),最后加入顯色液通過GE化學發光檢測儀檢測成像,檢測結果利用Imagine J分析統計。

1.6 免疫熒光檢測

將細胞爬片放置在12孔板中,按照5×104·孔-1接種細胞,待細胞貼壁后吸出培養液,1 mLPBS潤洗3遍后,用4%的多聚甲醛固定20 min,然后棄去固定液并用1 mL PBS潤洗2遍,洗后用0.5%的TritonX-100通透30 min,用3%BSA封閉1 h,棄掉封閉液并加入一抗過夜孵育(3% BSA按照1∶200比例稀釋一抗),孵育完成后再用PBS潤洗3遍,接著37 ℃避光孵育熒光二抗1 h(PBS按照1∶500稀釋二抗),用含有DAPI的封片劑封片,通過激光共聚焦顯微鏡采集成像。

1.7 代謝物檢測

在10 μL待測樣品中加入40 μL樣品稀釋液,然后加入100 μL辣根過氧化物酶(HRP)標記的抗體進行抗體檢測,將反應孔用封板膜封好,在37 ℃恒溫培養箱中溫育60 min,5次洗板后,分別加入50 μL底物A和50 μL底物B,37 ℃避光孵育15 min,加入50 μL終止液靜置15 min,在波長450 nm處檢測OD值。

1.8 CCK8法檢測細胞活力

將細胞懸浮液(100 μL·孔-1)接種于96孔板上,在恒溫培養箱(37 ℃,50 mL·L-1CO2)培育一段時間后,每孔加入10 μL CCK8溶液,將96孔板放置在恒溫培養箱中孵育1～4 h,在450 nm處測定OD值。

1.9 統計學處理

2 結 果

2.1 BCG感染上調凋亡相關蛋白Caspase 3和PARP的表達

為了探究BCG感染對巨噬細胞凋亡的影響,本研究設計了不同的感染時間及感染復數,并通過Western blot檢測BCG感染后Caspase 3和PARP的蛋白表達差異。結果表明(圖1),BCG感染后,Caspase 3和PARP的表達極顯著上調(P<0.001),并且隨時間和濃度逐漸升高,最佳感染復數為10 MOI,感染時間為12 h時。

A. Western blot檢測BCG感染不同時間Caspase 3和PARP的表達情況;B、C. 定量分析結果;D. Western blot檢測BCG感染不同復數Caspase 3和PARP的表達情況;E、F. 定量分析結果;*. P<0.05; **. P<0.01; ***. P<0.001A. Western blot analysis of caspase 3 and PARP in RAW264.7 cells infected with BCG for 6, 12, 18 and 24 h. B, C.The protein ratio was calculated by Image J densitometric analysis.; D. Western blot analysis of caspase 3 and PARP expression in RAW264.7 cells infected with BCG at MOI of 5, 10, 15 and 20 for 12 h.; E, F. Quantitative analysis results; *. P<0.05; **. P<0.01; ***. P<0.001圖1 BCG感染巨噬細胞后對Caspase3和PARP蛋白表達的影響Fig.1 Expression of Caspase 3 and PARP in RAW264.7 cells after BCG infection

2.2 BCG感染促進RAW264.7細胞內谷氨酰胺分解代謝

在宿主抵抗Mtb感染的過程中,巨噬細胞的代謝重編程在免疫應答的啟動和調節中起著關鍵的作用,為了探究BCG感染的RAW264.7細胞內谷氨酰胺代謝的變化,采用ELISA檢測了BCG感染不同時間細胞內谷氨酰胺及其代謝物的表達差異。結果如圖2所示,BCG感染促進了RAW264.7細胞內的谷氨酰胺代謝,在感染后24 h內,谷氨酰胺和α-KG含量隨著感染時間降低,谷氨酸的含量隨感染時間升高。為了進一步驗證BCG感染對谷氨酰胺代謝的影響,采用Western blot檢測谷氨酰胺代謝關鍵因子SCL1A5、GLS和GLUD的表達。結果如圖3所示,BCG感染后SLC1A5極顯著上調(P<0.001),GLS顯著上調(P<0.05)及GLUD極顯著下調(P<0.01),結果表明,BCG感染促進了細胞谷氨酰胺代謝為谷氨酸,同時抑制了谷氨酸的下游代謝,導致了谷氨酸的累積。

A. BCG感染的細胞內谷氨酰胺含量;B. BCG感染的細胞內谷氨酸含量;C.BCG感染的細胞內含量α-酮戊二酸含量; D. BCG感染的細胞內谷胱甘肽含量。*. P<0.05; **. P<0.01; ns. P>0.05A. Intracellular glutamine content in BCG-infected cells; B. Intracellular glutamate content in BCG-infected cells; C. Intracellular content α-ketoglutarate content in BCG-infected cells; D. Intracellular glutathione content in BCG-infected cells. *. P<0.05; **. P<0.01; ns. P>0.05圖2 BCG感染后巨噬細胞內谷氨酰胺分解途徑相關代謝產物的含量變化Fig.2 Changes of glutaminolysis pathway related metabolites in macrophages after BCG infection

A. Western blot檢測BCG感染后谷氨酰胺分解途徑關鍵蛋白的表達情況;B、C、D. 定量分析結果;E. BCG感染的細胞內谷氨酰胺分解途徑示意圖(紅色箭頭表示代謝產物/蛋白含量下調;綠色箭頭表示代謝產物/蛋白含量上調)。 *. P<0.05; **. P<0.01; ***. P<0.001A. Western blot detection of expression of key proteins of glutamine catabolic pathway after BCG infection; B, C, D.Results of quantitative analysis; E. Schematic diagram of intracellular glutamine catabolic pathway in BCG infection (red arrows indicate down-regulation of metabolite/protein content; green arrows indicate up-regulation of metabolite/protein content). *. P<0.05; **. P<0.01; ***. P<0.001圖3 BCG感染的巨噬細胞內谷氨酰胺分解途徑關鍵酶的蛋白表達水平Fig.3 Protein expression levels of key enzymes of the glutaminolysis pathway in BCG-infected macrophages

2.3 谷氨酰胺剝奪模型構建

為了探究谷氨酰胺和凋亡之間的關系,利用無谷氨酰胺培養基構建谷氨酰胺剝奪模型,設置了Gln濃度分別為0、4和12 nmol·L-1,采用CCK8法檢測了不同谷氨酰胺濃度下RAW264.7細胞的生長情況。結果如圖所示(圖4A),在0～48 h,內細胞在谷氨酰胺濃度為4 nmol·L-1的培養基中生長狀況最好,在谷氨酰胺濃度為12和8 nmol·L-1的培養基中次之,在無谷氨酰胺的培養基中生長最為緩慢,同時研究發現在48 h內剝奪谷氨酰胺并不會導致巨噬細胞死亡。因此,本研究通過外源添加谷氨酰胺,設置了谷氨酰胺濃度0、4、12 nmol·L-1,檢測了BCG感染后巨噬細胞內谷氨酰胺及其代謝物的含量。結果發現,剝奪谷氨酰胺降低了細胞內谷氨酰胺、谷氨酸和谷胱甘肽的含量(圖4B～D),表明細胞對谷氨酰胺的攝取能力和濃度呈正相關。

A. 不同谷氨酰胺濃度下細胞的生長情況;B. 細胞對谷氨酰胺的攝取情況;C. 細胞內谷氨酸的含量;D.細胞內谷胱甘肽含量;*. P<0.05; **. P<0.01; ***. P<0.001A. Cell growth at different glutamine concentrations; B. Cell uptake of glutamine; C. Intracellular glutamate content; D. Intracellular glutathione content; *. P<0.05; **. P<0.01; ***. P<0.001圖4 剝奪谷氨酰胺對BCG感染的巨噬細胞內谷氨酰胺及其代謝產物的影響Fig.4 Effect of glutamine deprivation on intracellular glutamine and its metabolites in BCG-infected macrophages

2.4 剝奪谷氨酰胺促進BCG感染的RAW264.7細胞凋亡

隨后,為了探究谷氨酰胺及其代謝對RAW264.7細胞凋亡的調控作用,采用流式細胞術檢測BCG感染后不同谷氨酰胺濃度下細胞的凋亡率,通過Western blot檢測凋亡相關蛋白Caspase 3和PARP的蛋白表達差異。結果顯示(圖5),在BCG感染條件下,剝奪谷氨酰胺可以極顯著增加RAW264.7細胞的凋亡率(P<0.01),促進Caspase 3和PARP的蛋白表達,同時免疫熒光的結果也得到了驗證,以上研究均證明剝奪谷氨酰胺可以促進BCG感染的RAW264.7細胞凋亡。

A. 流式細胞儀檢測細胞凋亡率;C. Western blot檢測Caspase 3和PARP的表達情況;B、D. 定量分析結果;*. P<0.05; **. P<0.01; ***. P<0.001A. Apoptosis rate by flow cytometry; C. Expression of Caspase3 and PARP; B, D. Results of quantitative analysis; *. P<0.05; **. P<0.01; ***. P<0.001圖5 剝奪谷氨酰胺對BCG誘導巨噬細胞凋亡的影響Fig.5 Effect of glutamine deprivation on BCG-induced apoptosis

圖6 免疫熒光檢測不同處理組巨噬細胞內Caspase 3的表達Fig.6 Immunofluorescence was used to detect the expression of Caspase 3 in macrophages of different treatment groups

2.5 剝奪谷氨酰胺造成巨噬細胞內ROS累積并通過內源途徑促進了凋亡

為了進一步明確剝奪谷氨酰胺對BCG感染巨噬細胞凋亡的調控機制,本研究通過流式細胞術和Western blot檢測了細胞內ROS的含量和內源性凋亡蛋白Bcl-2、Bax和Cytc的蛋白表達水平,結果顯示(圖7),剝奪谷氨酰胺極顯著降低了抑凋亡蛋白Bcl-2(P<0.001)的表達,極顯著增加了Bax(P<0.001)和Cytc(P<0.01)蛋白的表達,同時促進了ROS的累積(P<0.001)。結果表明,剝奪谷氨酰胺可能通過下調谷氨酰胺代謝產物谷胱甘肽,導致ROS累積,并通過內源途徑促進了BCG感染的RAW264.7細胞凋亡。

A. 流式細胞術檢測ROS; B. A圖的定量分析; C. Western blot檢測Bcl-2、Bax和Cytc的表達情況;D、E、F. C圖的定量分析結果;*. P<0.05; **. P<0.01; ***. P<0.001A. Flow cytometry detection of ROS; B. Quantitative analysis results of Fig.A; C. Western blot detection of Bcl-2, Bax and Cytc expression; D, E, F. Quantitative analysis results of Fig. C; *. P<0.05; **. P<0.01; ***. P<0.001圖7 剝奪谷氨酰胺對巨噬細胞內源性凋亡的影響Fig.7 Effect of glutamine deprivation on endogenous apoptosis of macrophages

3 討 論

細胞凋亡是機體為了應對病原的感染而主動選擇的一種程序性死亡方式,當Mtb感染巨噬細胞后,巨噬細胞可以通過凋亡來清除Mtb,阻止其在體內的進一步感染,但最終凋亡是否發生、Mtb能否存活則受到細胞內多種因子的調控。其中,Mtb和巨噬細胞之間的博弈過程復雜且仍未完全闡明[21]。機體在維持生存和抗感染的過程中,巨噬細胞為了有效地發揮自身的免疫功能會不斷地改變和調整自身的代謝狀態,同時病原菌會主動從宿主細胞攝取能量進而導致細胞的代謝重編程[22]。代謝重編程會引起細胞內外特定的代謝水平發生變化,從而影響基因的表達及細胞的狀態,進而調控細胞的免疫反應,代謝和免疫之間相互影響共同維護機體的穩態[22-23]。

谷氨酰胺是許多代謝途徑的關鍵底物,它可以通過GLS、GLUD等一系列關鍵酶分解成α-KG進入三羧酸循環向細胞提供能量,同時谷氨酰胺代謝中間產物也通過參與各種信號轉導、轉錄通路調節細胞的免疫應答反應[24-25]。研究發現,在過敏性哮喘、炎癥性腸病中,抑制谷氨酰胺代謝可以抑制參與炎性疾病和自身免疫疾病的T細胞發揮功能,減緩炎癥反應,但谷氨酰胺對巨噬細胞的調控作用研究未見報道[26]。本研究擬從谷氨酰胺代謝角度解釋Mtb誘導巨噬細胞凋亡的作用機制(圖8),前期研究發現BCG誘導RAW264.7細胞發生凋亡,且在感染BCG期間巨噬細胞對谷氨酰胺的消耗增加,并在抑制谷氨酸下游代謝的同時促進谷氨酰胺向谷氨酸及谷胱甘肽分解代謝,那么谷氨酰胺及其代謝的改變是否會影響宿主細胞的免疫應答,進而阻止Mtb的擴散呢?為了探究谷氨酰胺及其代謝對巨噬細胞凋亡的調控作用及機制,本研究首先設置不同時間和濃度的BCG感染RAW264.7,明確BCG感染的最佳條件,接著構建谷氨酰胺剝奪細胞模型,通過流式細胞術、免疫熒光、Western blot等多種方法證明了剝奪谷氨酰胺促進了BCG感染的巨噬細胞凋亡。試驗結果與其他學者在p2/0小鼠雜交瘤細胞中“剝奪谷氨酰胺后上調了Cytc和SMAC,激活Caspase 9和Caspase 3,誘導細胞發生凋亡”的結果一致[27-28]。同時,谷胱甘肽可以中和胞內自由基以阻斷細胞毒性作用及刺激外源性物質的外排,并且也可以作為一種信號分子直接或間接地調控細胞程序性死亡[29-31]。這些結果表明,抑制谷氨酰胺代謝通過降低細胞內谷胱甘肽的含量,導致ROS的累積,通過內源途徑促進了細胞的凋亡。研究結果對揭示Mtb的致病機制提供了新的解讀視角,并對抑制谷氨酰胺代謝是否作為潛在的治療靶點提供了試驗依據。

圖8 谷氨酰胺及其代謝影響BCG誘導的巨噬細胞凋亡的可能機制Fig.8 Possible mechanisms by which glutamine and its metabolism affect BCG-induced apoptosis in macrophages

4 結 論

BCG感染促進了RAW264.7細胞的谷氨酰胺代謝,同時誘導細胞發生凋亡。在此過程中,抑制谷氨酰胺代謝可降低細胞內谷胱甘肽的含量,造成ROS的累積,促進Cytc(P<0.01)、Bax(P<0.001)蛋白的表達,進而通過內源途徑促進了巨噬細胞的凋亡。