水產用微生物制劑源細菌的分離鑒定及耐藥性分析

王紅莉，劉麗娟，張德鋒，尹紀元，石存斌，任 燕，夏蘇東，王 慶

(1.天津農學院水產學院，天津 300384；2.中國水產科學研究院珠江水產研究所，農業農村部漁用藥物創制重點實驗室，廣州 510380)

隨著我國水產養殖設施化、集約化和規模化的快速發展，高密度養殖已成為當前的主流[1]。在追求高密度養殖過程中，養殖水環境承受巨大壓力，水產養殖經濟動物病害頻發，制約了水產養殖業的健康可持續發展。為了防控養殖動物病害暴發，需要大量使用抗生素、消毒劑等化學藥物。然而，這些藥物的長期使用，不僅加劇了細菌耐藥性的產生和耐藥基因的傳播，而且水產品中的藥物殘留也危害人類健康。在當前我國努力遏制細菌耐藥，維護人民群眾健康的政策下，綠色健康養殖是今后水產養殖發展的必由之路。

微生物制劑指一類在自然環境中篩選得到的有益微生物及其代謝產物經過特殊加工制備而成的生物制劑[2]。目前，光合細菌、硝化細菌、酵母菌、腸球菌、芽孢桿菌、乳酸菌等廣泛應用于凈化養殖環境、提高動物生產性能和抗病力等方面，是常用的微生物制劑[3]。例如，光合細菌、芽孢桿菌和硝化細菌等，因其能夠降解養殖水體中的有機物、氨氮和亞硝酸鹽等，常被用作水體改良劑[4]。一些具有拮抗抑菌活性的益生菌如貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)、乳酸菌因其能夠產生抑菌物質從而控制病原菌的生長繁殖，具有良好的生防作用效果，是常有的生防菌[5，6]。芽孢桿菌、酵母菌、腸球菌等益生菌具有增強消化酶活性，提高飼料利用率，改善腸道菌群，提高水產動物的免疫力等功能，通常用于飼料添加劑[7，8]。

我國水產用微生物制劑的發展較晚，缺乏完善的市場監管系統，產品良莠不齊，其安全性難以保證。本實驗旨在通過分離市售水產微生物制劑中的細菌，并進行耐藥性分析以及耐藥基因檢測，進而評估水產用微生物制劑的安全性，為水產養殖中益生菌的篩選和安全應用提供科學依據。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

從市場上購買35個廠家常見的45種微生態制劑(表1)。乳酸菌培養基(MRS)、牛肉膏蛋白胨培養基(LB)和水解酪蛋白胨培養基(MH)均購于廣州環凱微生物科技有限公司；瓊脂粉購于北京奧賽星生物技術有限公司；藥敏紙片購于杭州微生物試劑有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒購于天根生化科技(北京)有限公司。

表1 微生態制劑產品信息Tab.1 Information of the microbial agents in this study

1.2 實驗方法

1.2.1 細菌的分離與培養

將購買的微生物制劑進行10倍系列梯度稀釋為10、100、1 000和10 000倍稀釋液，分別吸取100 μL涂布于LB固體平板和MRS固體平板，LB固體平板置于28 ℃培養24 h，MRS固體平板置于28 ℃培養48 h。挑取形態、大小不同的菌落進行二次劃線培養，并根據菌落形態特征進行第三次劃線培養，直至獲得純培養物。收集純培養物，加入LB或MRS液體培養基，并加入無菌甘油使其終濃度為20%，轉移至菌種保藏管中置于-80 ℃冰箱中保存。

1.2.2 分離菌株的基因組DNA提取

將獲得的純培養物接種到LB或MRS液體培養基中，其中MRS平板上篩選的菌株接種于MRS液體培養基，其它細菌接種于LB液體培養基，置于28 ℃、200 r/min恒溫搖床培養8～12 h，收集菌體，使用細菌基因組DNA提取試劑盒分別提取分離菌株的基因組DNA，將提取的DNA樣品置于-18 ℃冰箱中保存備用。

1.2.3 分離菌株的鑒定

以提取的細菌基因組DNA為模板，通過PCR擴增分離菌株的16S rRNA和gyrB基因，16S rRNA的上游引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，下游引物1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′，芽孢桿菌屬gyrB[9]的上游引物：5′-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA-3′下游引物：5′-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRTCNGTCAT-3′。PCR反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s；52～56 ℃退火30 s；72 ℃延伸1 min；35個循環；72 ℃終延伸10 min。PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測后，陽性PCR產物委托廣州艾基生物技術有限公司測序。測序結果在NCBI中的Blastn上進行序列初步的比對分析。

1.2.4 藥敏實驗

參考美國臨床與實驗室標準協會(CLSI)規定的紙片瓊脂擴散法(K-B法)檢測分離菌株對11種抗生素的敏感性[10]。以金黃色葡萄球菌ATCC25923(芽孢桿菌和腸球菌的質控菌株)和大腸桿菌ATCC25922(乳桿菌和片球菌的質控菌株)作為質控菌株對分離菌株進行11種抗生素的藥敏實驗。所用抗生素為氯霉素、恩諾沙星、羅紅霉素、復方新諾明、鏈霉素、四環素、慶大霉素、青霉素、氟苯尼考、萬古霉素、頭孢氨芐。藥敏實驗的具體操作步驟參考文獻[11，12]，將分離得到的乳桿菌和片球菌在MRS固體平板上培養48 h，然后挑取單克隆菌落接種于MRS液體培養基，其它菌株在LB固體平板上培養24 h后，挑取單克隆菌落接種于LB液體培養基，將液體培養基于37 ℃、200 r/min 搖床培養12 h，收集菌體，以0.65%生理鹽水重懸，使用麥氏比濁儀將菌液濃度調整為0.5個麥氏標準單位，吸取200 μL菌懸液均勻涂布于MRS固體平板、MH固體平板，乳桿菌和片球菌的菌懸液涂布于MRS固體平板，其它菌株涂布于MH固體平板，待干后再使用無菌鑷子將藥敏片貼于平板上，MRS固體平板于37 ℃培養箱培養48 h，MH固體平板于37 ℃培養箱培養24 h，每組三個平行，培養結束后測量并記錄抑菌圈直徑，受試菌株藥敏性的判定標準參考文獻[10]，對于缺乏耐藥、中度敏感(中介)和敏感范圍的芽孢桿菌、乳桿菌和片球菌參考其質控菌株金黃色葡萄球菌ATCC25923和大腸桿菌ATCC25922的判定標準，芽孢桿菌參考葡萄球菌的藥敏性判定標準，乳桿菌和片球菌參考腸桿菌的判定標準。各藥敏紙片的含藥量及主要分離菌株藥物敏感性的判定標準見表2。

表2 抗菌藥物敏感性判定標準Tab.2 Decision criteria of antimicrobial susceptibility test

1.2.5 抗生素抗性基因的檢測

以提取的細菌基因組為模板，采用PCR的方法檢測以下抗性基因(antibiotics resistance genes，ARGs)[13-15]：磺胺類耐藥基因(sul1、sul2、sul3)、四環素類耐藥基因(tetA、tetB、tetC、tetD、tetE、tetM)、氨基糖苷類耐藥基因(strA、strB、aac2、aadA、aadK)、大環內酯類耐藥基因(ermB、mefA、mphA)、β-內酰胺類耐藥基因(blaOXA、blaTEM)。引物序列和退火溫度見表3，PCR反應程序參考“1.2.3”，陽性PCR擴增產物委托廣州艾基生物技術有限公司進行測序，測序結果用NCBI官網中的Blastn程序與GenBank數據庫進行比對。

表3 耐藥基因引物Tab.3 The primer sequences of ARGs

2 結果

2.1 細菌的分離與鑒定

從45種微生態制劑中共分離純化獲得211株細菌，分離菌株的16S rRNA基因的PCR擴增產物測序結果進行在線Blastn(https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？PROGRAM=blastn&PAGE_TYPE=BlastSearch&BLAST_SPEC=&LINK_LOC=blasttab)比對分析，初步確定分離菌株的種屬分類地位。此外，下載NCBI中與分離菌株16S rRNA基因序列同源性高的芽孢桿菌、腸球菌、乳桿菌等細菌的16S rRNA基因序列，利用MEGA11軟件采用N-J法(Neighbor-Joining，NJ)構建分離菌株的16S rRNA基因系統發育樹(圖1)。除芽孢桿菌屬的細菌外，其余菌株均可與其相對應的細菌16S rRNA基因歸于一簇，能夠利用16S rRNA基因的比對結果和構建的系統發育樹將這些細菌確定到種。而芽孢桿菌種屬間的16S rRNA基因同源性較高，考慮到芽孢桿菌不同菌種的gyrB基因具有明顯的差異性，故采用gyrB基因進一步確定其所屬菌種[9]。下載NCBI上與芽孢桿菌同源性高的各菌種gyrB基因序列，利用MEGA 11軟件構建芽孢桿菌的gyrB系統發育樹(圖2)。在gyrB系統發育樹中，不同種類的芽孢桿菌被劃分為8簇，基于gyrB基因序列的比對結果和構建的gyrB系統發育樹從而確定芽孢桿菌的菌種。根據Blastn比對分析結果、16S rRNA 和gyrB系統發育樹的結果，確定分離菌株隸屬于9個屬20個菌種，并且以芽孢桿菌屬(Bacillus)、腸球菌屬(Enterococcus)和乳桿菌屬(Lactobacillus)為主，其比例分別為71.1%、16.6%、7.6%；產品中菌株的具體分離結果見表4和表5。

圖2 基于芽孢桿菌gyrB基因序列的系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree was constructed based on gyrB gene sequences of Bacillus

表4 微生物制劑源菌株分離情況Tab.4 Information of the strains isolated from microbial agents

2.2 藥敏實驗

質控菌株對各抗生素的藥敏實驗結果在規定的質控范圍內，表明藥敏實驗結果可靠。從微生物制劑中分離的211株細菌中有98(46.7%)株菌株表現不同程度的耐藥性(圖3)，分離菌株中對磺胺類、氨基糖苷類和大環內酯類抗生素的耐藥率最高，分別為27.9%、23.7%、19.9%；頭孢類、糖肽類和青霉素類抗生素的耐藥菌株比例分別為17.0%、15.6%、13.7%；四環素類、喹諾酮類和酰胺醇類抗生素表現耐藥的菌株比例較低，分別為7.6%、6.2%和1.4%。其中，150株芽孢桿菌中有45株表現耐藥，耐藥芽孢桿菌對除氟苯尼考以外的抗生素表現出不同程度的耐藥，對慶大霉素、氯霉素、恩諾沙星、頭孢氨芐、鏈霉素、萬古霉素、四環素、羅紅霉素、復方新諾明、青霉素表現耐藥的菌株比例分別為0.7%、0.7%、0.7%、1.3%、2.0%、6.7%、6.7%、10.7%、13.3%、15.3%(表6)。分離菌株中多重耐藥菌株的比例為30.8%(圖4)，芽孢桿菌主要表現為2重耐藥和3重耐藥；乳酸菌和腸球菌的耐藥性較強，乳桿菌和乳球菌主要表現為4重和5重耐藥，腸球菌主要表現為3重、4重和5重耐藥。

圖3 分離菌株藥敏實驗結果Fig.3 The results of the antibiotic sensitivity test of isolates

圖4 分離菌株的多重耐藥情況Fig.4 The distribution of multi-drug resistance of isolates

表6 芽孢桿菌對不同藥物的敏感性Tab.6 Susceptibility of Bacillus to different antibiotics

2.3 ARGs的定性檢測及分布

根據藥敏實驗結果，挑選79株耐藥性較強和耐藥重數較高的耐藥菌株，其中有28株芽孢桿菌(11株枯草芽孢桿菌、6株地衣芽孢桿菌、5株短小芽孢桿菌、2株貝萊斯芽孢桿菌、2株蠟樣芽孢桿菌、1株副地衣芽孢桿菌、1株蘇云金芽孢桿菌)、28株腸球菌、16株乳桿菌、3株醋桿菌、2株片球菌、1株鄰單胞菌和1株腸桿菌，進一步對其耐藥基因和可移動遺傳元件(整合子int1、int2和共軛轉座子Tn916/1545)進行檢測。耐藥基因的PCR電泳檢測結果如圖5，對陽性PCR擴增產物進行測序，測序結果用NCBI官網中的Blastn程序與GenBank數據庫進行比對，序列與數據庫的相應基因的序列相似性≥97%，確定擴增產物為目的耐藥基因。本研究發現79株耐藥菌株中檢出耐藥基因的共計59株，不同種屬檢出耐藥基因的菌株結果見表7，并且sul2、sul3、tetC、aadK、aadA、ermB、mefA耐藥基因的檢出率分別為34.2%、26.6%、7.6%、53.2%、19.0%、10.1%、2.5%，其他耐藥基因檢測結果為陰性(表7)。氨基糖苷類和磺胺類耐藥基因的檢出率顯著高于其它耐藥基因，分別為53.2%和40.5%，并且79株耐藥菌株中攜帶多重耐藥基因的菌株比例為40.5%，以腸球菌同時攜帶氨基糖苷類和磺胺類耐藥基因為主。可移動遺傳元件(共軛轉座子Tn916/1545)檢出率為13.9%，未檢測到int1和int2。

圖5 耐藥基因PCR擴增產物的電泳圖譜Fig.5 Detection of drug resistance genes by electrophoresisMarker：DL1000；1-7：sul3，sul2，tetC，aadK，aadA，ermB，mefA。

3 討論

本研究從45種水產用微生物制劑中分離到211株細菌，分離菌株經過分子生物學鑒定，結果顯示這些菌株可分為9個屬，其中芽孢桿菌屬比例最高(72.0%)；其次是腸球菌屬(16.6%)，再次是乳桿菌屬(7.6%)。根據2013年農業部發布的飼用添加菌種名單，本研究中分離的菌株符合上述名單的菌株只有137株[16]，其比例為64.9%。從微生物制劑里還分離得到4株潛在的致病菌，分別是3株蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)和1株類志賀鄰單胞菌(Plesiomonasshigelloides)，只有一株蠟樣芽孢桿菌不具有溶血活性，其余3株菌株均具有溶血活性，并且，分離得到的蠟樣芽孢桿菌攜帶溶血性腸毒素基因(hblA、hblB)，不符合我國飼用微生物添加劑使用菌株的安全標準；對分離的4株潛在致病菌進行了其對斑馬魚(Daniorerio)的致病性實驗，斑馬魚在攻毒7天內均有不同程度的死亡現象(25%～90%)，表明這4株細菌均具有一定的致病性。蠟樣芽孢桿菌是引起食源性疾病的常見細菌之一，當食品中蠟樣芽孢桿菌的數量超過103CFU/g時，會對食用者造成潛在的危害，因此，諸多國家為防止蠟樣芽孢桿菌導致食物中毒對其在食品中的含量進行了明確規定，蠟樣芽孢桿菌能夠通過產生腸毒素和嘔吐毒素導致食物中毒，主要癥狀表現為嘔吐、腹瀉，臨床上偶爾會通過菌體感染導致眼部疾病、心內膜炎、腦膜炎、菌血癥等疾病[17]；蠟樣芽孢桿菌同樣可以導致多種水產經濟動物如半滑舌鰨(Cynoglossussemilaevis)[18]、羅非魚(Oreochromisniloticus)[19]等發病甚至死亡。類志賀鄰單胞菌是一種可導致人、畜、魚共患病的條件致病菌，類志賀鄰單胞菌感染能夠引起急性腸胃炎、腦膜炎、蜂窩組織炎、骨髓炎、菌血癥等疾病[20]。這兩種致病菌均可使人、畜、魚患病，水產用微生物制劑中含有致病菌不僅對養殖動物造成潛在的致病風險，而且可能會危害水生態環境，進而威脅公共衛生安全。

表8 抗生素抗性基因檢出率Tab.8 Detection rate of ARGs

抗生素的長期使用引起養殖環境中的細菌普遍具有耐藥性和抗性基因，微生物制劑中的菌株主要來源于養殖環境和健康動物，若生產廠家開發微生物制劑時未對其進行耐藥性檢測或者生產過程不規范引入了其他的耐藥性細菌等，均會增加市售微生物制劑中存在耐藥菌和耐藥基因的可能性。通過對微生物制劑中分離得到的菌株進行實驗室常用抗生素的耐藥性檢測，我們發現46.7%的菌株表現不同程度的耐藥性，其中對氨基糖苷類、β-內酰胺類和磺胺類抗生素耐藥的菌株比例最高，可能與這些抗生素作為獸藥的使用歷史悠久，以及抗生素的濫用有關，因為每年的水產品樣品檢測中時常有關于檢出禁用抗生素和可用抗生素超限量使用的報道[21]。根據藥敏實驗結果，本研究進一步對耐藥菌的耐藥基因及可移動遺傳元件進行檢測，耐藥基因sul2、sul3、tetC、aadA、aadK、ermB、mefA、Tn916/1545的PCR擴增序列與數據庫的相應序列相似性≥97%，進一步驗證了陽性PCR產物擴增的結果。氨基糖苷類、磺胺類耐藥基因的檢出率與藥敏實驗結果的氨基糖苷類、磺胺類耐藥菌耐藥比例相符；然而，β-內酰胺類和大環內酯類耐藥基因檢出率與藥敏實驗結果不符，這可能是由于乳酸菌對β-內酰胺類抗生素具有天然的耐藥性，而腸球菌細胞壁堅厚，抗生素難以進入菌體，并且腸球菌可產生一種特殊的青霉素結合蛋白(PBPS)導致其對青霉素耐藥[22]，而大環內酯類耐藥基因的檢出率低于其耐藥表型，可能是由于大環內酯類耐藥基因眾多，本研究中僅檢測了幾種常見的大環內酯類耐藥基因，存在部分耐藥基因未被檢測到，可能正是由于這些原因造成了β-內酰胺類和大環內酯類耐藥菌數量多但耐藥基因檢出率低的原因。

本研究中74.7%耐藥菌株攜帶耐藥基因，耐藥基因sul2、sul3、tetC、aadK、aadA、ermB、mefA檢出率分別為34.2%、26.6%、7.6%、53.2%、19.0%、10.1%、2.5%，表明大規模使用相關產品會造成耐藥基因擴散的安全風險。耐藥基因的水平轉移是細菌獲得性耐藥的主要方式，即使攜帶ARGs的菌株死亡，仍然可以將攜帶ARGs的DNA釋放環境中，并可以轉移到其它微生物體內[23]。施嘉琛等[24]發現北京溫榆河流域大腸桿菌(Escherichiacoli)對氨芐青霉素、四環素、磺胺和左氧氟沙星耐藥率分別為10%～35%、5%～25%、10%～35%、0～15%，且隨著抗生素使用時間的增加，耐藥率也逐漸增高。魏文娟等[25]檢測了36株對蝦源副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)對16種抗生素的耐藥性及相關耐藥基因攜帶情況，發現檢測菌株均表現耐藥以及檢出耐藥基因，但耐藥基因的檢出率與耐藥表型并不完全相符，與本研究結果一致，體現了細菌耐藥機制的復雜性和耐藥基因的多樣性。洪斌等[26]分析了凡納濱對蝦((Litopenaeusvannamei)和羅氏沼蝦(Macrobrachiumrosenbergii)腸道微生物的耐藥性，凡納濱對蝦腸道微生物攜帶15種ARGs，tetA、tetS、strA、strB、floR、sul2耐藥基因的檢出率為100%，羅氏沼蝦腸道微生物攜帶14種ARGs，其中，SHV、tetA、tetS、aadA、qnrS、sul1、sul2耐藥基因的檢出率為100%。由于不同地區抗生素的使用劑量和使用頻率不同，養殖環境、養殖動物體內耐藥菌和耐藥基因的分布和豐度也有相應的差異，農業農村部在《直接飼喂微生物和發酵制品生產菌株鑒定及其安全性評價指南》中將攜帶獲得性耐藥基因的微生物制劑產品判定為具有危害[27]，微生物制劑中耐藥基因的檢出，表明這些不合格的微生物制劑產品具有一定的安全風險，在實際應用時，可能會大量使用這些不合格的微生物制劑，具有成為耐藥基因儲存庫的可能性，從而影響環境中耐藥菌及耐藥基因的分布和豐度，尤其對抗生素抗性基因豐度低的環境，風險更大，并且，耐藥菌攜帶的耐藥基因可以通過多種方式轉移到其它微生物和動物體內，進而威脅人類健康和生態安全。

耐藥菌可通過整合子、轉座子、接合性質粒等遺傳元件在細菌間水平傳播耐藥基因，整合子和轉座子不僅是ARGs實現水平轉移的重要媒介，同時也介導細菌產生多重耐藥[28]。劉淑梅等[29]調查了390株多重耐藥腸球菌的耐藥性及整合子的攜帶情況發現，53.1%的糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)和51.5%的屎腸球菌(E.faecium)攜帶Ⅰ類整合子int1，所有整合子均攜帶aadA2基因。左志晗等[30]研究發現天津市周邊地區凡納濱對蝦腸道中β-內酰胺類和磺胺類的耐藥菌的數量顯著高于其它類抗生素耐藥菌，磺胺類和青霉素類耐藥基因的檢出率最高為63%、61.4%，整合子int1和int2的檢出率分別為42.7%和41.5%。陳招弟等[13]研究發現100株微生物制劑源耐藥菌轉座子Tn916/1545、整合子int1、插入序列ISaba1和接合型質粒遺傳標記traA的檢出率分別為100%、91%、78%、23%，兩種及兩種以上的可移動遺傳元件檢出率為95%。因此，本研究對整合子int1、int2和轉座子Tn916/1545進行檢測，只有13.9%的耐藥菌株攜帶共軛轉座子Tn916/1545，并未檢測到整合子int1和int2，這也間接表明本研究中耐藥菌株攜帶可移動遺傳元件的比例較低，其耐藥基因水平轉移的風險相對較小。微生物制劑中可遺傳元件的檢出，表明其存在將耐藥基因水平轉移給其它微生物的可能性，具有一定的安全風險。

市售微生物制劑中檢測出潛在的致病菌、耐藥菌及抗生素抗性基因，表明相關產品存在一定的安全風險。不合格或不規范的微生物制劑可以成為耐藥基因的儲存庫，不僅增加耐藥菌的擴散，還會促進耐藥基因的水平傳播，帶來更多的生物安全風險。相關部門應完善生產和檢測標準，加強對微生物制劑的市場監管，培養專業人員建立完整的監管和可追溯體系，完善微生物制劑的標準體系，從而確保漁用微生物制劑的安全、高效，促進水產行業的綠色健康發展。