基因擴增技術在食品檢測中的質量控制要點

王 磊

（天津市食品安全檢測技術研究院，天津 300308）

聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）是基因擴增檢測技術最主要的應用方向，其原理為通過從樣本中提取核酸并進行擴增，分析目標基因序列，最終獲得樣本的物種信息。經過多年發展，該技術以普通PCR為基礎，已衍生出多重PCR、實時熒光定量PCR、數字PCR等多種應用途徑，并以其省時高效的優點被廣泛應用于食品安全等檢測領域[1]。本文結合實際工作經驗，對PCR檢測技術的主要應用范圍進行論述，針對內、外源影響因素，對檢測的質量控制要點進行了總結，以期為相關實驗室的建設提供參考依據。

1 基因擴增技術在食品檢測中的主要應用

1.1 致病性微生物檢測

食源性致病微生物檢測一般以致病菌為主，其常規檢測方法為培養法，耗費時間長。PCR技術作為其輔助手段，既可以用于檢測末端對菌株進行鑒定，也可用于前端對增菌液進行初篩，具備靈活準確的特點，但其囿于原理，無法考查微生物的生物活性。目前，PCR技術用于致瀉大腸埃希氏菌和諾如病毒的檢測方法已經被食品安全國家標準采用，用于沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等常見致病菌的鑒定方法及商品化試劑也已被相繼研發。

1.2 動物源性成分檢測

動物源性成分鑒定主要用于肉制品摻假的檢測[2]，目前豬、牛、羊、馬、驢、雞和鴨等常見畜禽肉類的鑒定都已建立了相應標準。其中，以實時熒光PCR的應用較為突出，其優勢在于通過建立已知拷貝數的標準曲線，比對計算出目標拷貝數的初始含量，實現成分的相對定量分析。另外，可進行多種成分同時測定的多重PCR技術也逐漸得到應用。

1.3 過敏原成分檢測

食品過敏原包括甲殼類、魚類、蛋類、牛奶、花生、堅果、大豆、小麥以及芝麻等成分，現階段針對該類成分的檢測標準主要是用于出口食品的行業標準，方法上以熒光定量PCR法為主。與依賴于分析特定蛋白的方法相比，熒光定量PCR方法在檢測中顯示出較高的靈敏度和可靠性，更容易滿足該類成分微量、痕量的檢出需求[3]。

1.4 轉基因成分檢測

轉基因成分是最早應用基因擴增檢測技術的食品類別，普通PCR和熒光PCR技術在該領域中占主導地位。我國現已經頒布了包括通用要求和具體種類品系的一系列檢測標準，形成了比較完備的體系。實際檢測中需要考慮到領域中內源基因、外源基因、啟動子、終止子等特定概念[4]，對引物設計、結果判定等步驟進行系統性考量。

2 基因擴增檢測技術的質量控制要點

2.1 人員的控制

實驗室對檢測人員應進行定期培訓，重點在于分子生物學相關專業知識、實驗操作技能、規范化操作、污染預防處置辦法和生物安全等內容。同時實驗室應定期組織或參加實驗室間比對試驗，通過考核訓練提升檢測人員的操作技能。

PCR反應實驗具有精細微量的操作特點，檢測人員的業務熟練程度和責任心成為主導檢測結果有效性的決定性因素。因此，檢測人員必須嚴格執行質量體系規定的檢測流程、檢測方法，杜絕因操作不細致導致的結果異常甚至交叉污染的發生，同時也要求實驗室在質量監督活動中對檢測人員的實驗作風和實驗習慣加以重點考察。

2.2 儀器設備的控制

作為實現檢測過程的重要核心條件，PCR擴增儀、實時熒光定量PCR儀、生物安全柜、天平、低溫離心機、核酸濃度測定儀和移液器等儀器設備要按照規程要求定期進行維護、期間核查、檢定校準，保證其在規定參數內正常運行。同時應制定相應的設備防護程序，避免操作中核酸或試劑泄露對設備造成不良影響。

2.3 樣本和試劑耗材的控制

2.3.1 樣本

樣本的處理應按照方法和作業指導書嚴格進行，做好編號和相應登記。檢測人員根據樣本類型采取相適應的方式進行保存。制備樣本應及時進行核酸提取，核酸若需暫時儲存，應于-20 ℃以下保存，避免反復凍融；需要長時間保存的應儲存于-80 ℃條件下，保存期不宜超過6個月。

2.3.2 試劑和耗材

試劑質量直接影響PCR反應的檢測結果，故不得使用偽劣或過期試劑。實驗室應對每批次購進的新試劑與保存的陰、陽性標本進行同條件驗證試驗，質量驗收合格后方可使用。試劑保存應嚴格按照說明書放置在恒溫環境和專用冰箱中，未開封試劑與已部分使用試劑分開放置。需低溫保存又要經常使用的試劑需分裝后貯存備用，避免反復凍融和打開容器影響試劑質量，同時減少實驗室的偶然性污染機會。

實驗室各功能區所用的手套、移液器吸頭、離心管、反應管等物品均應一次性使用；加樣環節選用帶濾芯移液器吸頭，以防操作過程中引入污染。

2.4 檢測方法的控制

基因擴增實驗室應依據檢測方法制定相應的標準操作規程，明確相關注意事項，規程應涵蓋試劑準備、測定方法和儀器操作等內容。針對PCR實驗的特性，實驗室還需制定相應的試劑登記驗收程序、清潔程序、污染控制及消除程序和過程控制程序以保證檢測結果的有效性。在明確區分檢測項目個體化差異的基礎上，實驗室應根據具體情況對試驗程序進行規范完善，并定期對其進行檢查核對，持續改進，確保其時效性和適用性，做到檢測過程有章可循，檢測記錄有據可查。

2.5 檢測環境的控制

2.5.1 實驗室功能區域的劃分

基因擴增實驗室應具有充分、合理的空間，良好的照明和通風設備，并遵照檢測工作流程，按單向流動原則進行規范化分區。一般按照GB/T 27403——2008、GB/T 19495.2——2004將實驗室分隔為試劑配制和貯存區、樣品制備區、PCR反應配制區、擴增區和產物分析區5個工作區；也可按照GB/T 32146.3——2015分隔為試劑準備區、樣本制備區、擴增區和產物分析區4個工作區，實驗室應根據自身硬件條件和檢測方向需求，合理布局規劃[5]。

要求各功能區必須互相獨立，采取空間隔離并明確標識，應各自設有緩沖間，供更換工作服用；檢測空間應相對封閉，避免頻繁的空氣對流產生；各區的儀器設備、實驗用品和清潔工具必須專用，不得混用；各區應具備通風裝置，以便及時排除空氣中的核酸氣溶膠。最終實現檢測過程單向的操作流、人流、物流以及氣流，盡可能預防核酸污染對檢測結果造成干擾。

2.5.2 實驗室內部環境的控制

實驗室內部環境應始終圍繞預防和避免核酸污染這一原則進行控制。每次實驗操作前后應用紫外線照射整個試驗區域（≥30 min）；定期采用10%次氯酸鈉或1%過氧乙酸擦拭地面及工作臺以破壞殘留的核酸，并對實驗室進行換氣和消毒，預防空氣中氣溶膠污染源。

各區試驗結束后廢棄的樣本、反應管、移液器吸頭等物品應就地及時置于盛有10%次氯酸鈉的容器中浸泡（≥6 h），同時涉及微生物操作的所有廢棄物必須經過高壓滅菌并按醫療垃圾物處理，從而在實驗用品、設施和空氣環境中徹底控制污染源。

2.6 檢測過程的控制

2.6.1 核酸提取

核酸的提取是關系檢測結果是否成立的關鍵步驟，因此操作過程必須注意避免標本間的交叉污染及核酸模板的降解、丟失。提取所采用的吸頭、離心管的品質，開蓋、吸棄上清液等操作是否正確均會對檢測質量造成影響，檢驗人員必須時刻注意。

對于DNA的提取，建議采用操作相對簡便、人為影響因素較少的柱膜法或磁珠法，以取代傳統的CTAB抽提法；某些病毒檢測中則需制備RNA擴增樣本，在提取完成后應立即進行逆轉錄操作，合成較為穩定的cDNA，以便于保存。

2.6.2 反應液的配制

反應體系的配制是PCR檢測準確率的保障，應按試驗設計配制反應液。開關微量離心管時須雙手操作，手部應以最小面積接觸管上方，不得觸及管蓋內面；Taq酶、引物等試劑在開蓋前應低速瞬時離心，使附在管壁和管蓋的液體沉于管底，保證試劑濃度一致；應盡量減少試劑的開蓋次數和時間，防止空氣、吸頭、濺沫等污染試劑，同時為確保實驗體系的均一性，應對最終反應液反復抽吸混勻；考慮到吸取、分裝試劑時的誤差，所配制的反應液應比理論用量多出1～2孔的余量，以免實際用量不足。

空白對照、陰性對照和陽性對照是反應過程中最重要的主動質控方式，每次檢測實驗必須同時伴隨進行。加樣順序遵從核酸濃度由低到高的順序：①空白對照；②陰性對照；③樣品；④由低到高濃度加入標準品（定量實驗）；⑤陽性對照。

2.6.3 擴增和擴增產物的分析

PCR反應上機操作中，檢測人員應確保8聯排管或96孔板平衡放置；反應管加蓋或膜時，不得用記號筆標記，也不可觸摸管蓋或膜的下表面。

擴增產物在電泳操作上樣時應避免加樣液的溢出和點樣孔內有氣泡產生，避免PCR產物漂移到其他孔而影響結果判定；實驗結束后應立即對廢棄物進行無害化處理，嚴防產物核酸進入空氣，形成污染源。

3 結語

綜上，隨著我國食品安全保障水平的不斷提升，PCR技術在基層檢測機構得到推廣，現已經逐漸向普及化和常規化方向發展。由于該技術的高敏感特性，某些細微不確定因素即可導致假性（陰、陽）結果產生。為應對此情況，實驗室必須制定全方位的質量控制措施，提升人員檢測能力，優化試劑、設備、樣本、環境的管理，加強對檢測方法執行的過程控制，從而充分保證所出具檢測結果的有效性和可信度，使這種新興的檢測手段得到更有效、更長足的發展利用。