RRS1對乳腺癌細胞增殖和遷移的影響及其作用機制

吳清蘭 鄧林 孫文靜 張麗 張金平 侯琳

(1 青島大學基礎醫學院生物化學與分子生物學系,山東 青島 266071; 2 青島大學藥學院;3 中國人民解放軍海軍第971醫院泌尿外科)

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一,其發病率和死亡率正在逐年上升,嚴重威脅著女性的生命健康［1］。盡管在診斷和治療方面取得了進步,但是乳腺癌患者的復發率和死亡率仍然很高［2］。因此,需要更全面地了解乳腺癌發生和進展的潛在機制,以確定乳腺癌特異性的生物標志物以及治療靶點,改善乳腺癌的治療效果。核糖體合成調控因子1(RRS1)最早在酵母中被發現,由203個氨基酸組成,也是真核生物的保守蛋白［3］。RRS1在核糖體生物發生中扮演重要的角色,此外,RRS1還與細胞有絲分裂、端粒聚集以及染色體重排密切相關［3］。RRS1基因的異常表達會導致核糖體功能障礙,進一步影響蛋白質的合成。近幾年,多項研究表明RRS1在肝細胞癌［4］、結直腸癌［5］、宮頸癌［6］以及胃癌［7］等多種惡性腫瘤中過表達,提示其可能作為癌基因促進腫瘤生長和轉移。本課題組前期研究發現RRS1在乳腺癌中高表達,RRS1可以通過RPL11/MDM2/p53信號傳導促進乳腺癌細胞的增殖［8-9］。另外有研究結果顯示,RRS1基因可以通過RPL11/c-Myc/SNAIL軸調節人類乳腺癌細胞的侵襲和轉移［10］。由此可見,RRS1與乳腺癌的發生及進展密切相關,但RRS1在乳腺癌中的作用及其機制尚不明確,相關方面的報道也甚少。本研究通過觀察敲降RRS1基因對乳腺癌BT549細胞增殖和遷移的影響,探討RRS1在乳腺癌發生和進展中的潛在機制,以期能夠為乳腺癌的診斷和治療提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

細胞系MDA-MB-231、MCF-10A、MDA-MB-468、BT-549和MCF-7均購自中國科學院(昆明)細胞庫。CCK8試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司,RRS1、AKT、mTOR、p-AKT、p-mTOR抗體購買于英國Abcam公司,缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)以及GAPDH、血管內皮生長因子(VEGF)抗體均購自武漢愛博泰克生物科技有限公司,Trizoll Reagent、RNA定量試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司,RRS1敲降慢病毒購自上海吉凱基因醫學科技有限公司。

1.2 細胞培養

MDA-MB-231、MDA-MB-468、BT549、MCF-7和MCF-10A細胞置于含體積分數0.10的胎牛血清和青鏈霉素混合溶液(100 mg/L鏈霉素、100 mg/L青霉素)的DMEM培養基中,在37 ℃、含體積分數0.05 CO2條件下進行培養,根據細胞生長狀態換液傳代,培養兩代后,可進行細胞凍存及后續實驗。

1.3 免疫熒光檢測RRS1在BT549細胞中的定位

取生長狀態良好的BT549細胞,接種于鋪有細胞爬片的24孔板中,待細胞貼壁且形態完全舒展時,以40 g/L甲醛固定20 min,繼而以2 g/L的Triton X-100透化10 min,然后加入200 μL即用型山羊血清,室溫孵育30 min,PBST洗滌細胞3次。然后將細胞與RRS1(1∶200稀釋)一抗在4 ℃下孵育過夜,第2天,加入相應種屬的熒光二抗,室溫孵育1 h,PBST洗滌細胞3次,后置于暗室室溫下用DAPI染色5 min,PBST洗滌3次,將爬片取出,用封片劑固定在載玻片上,在共聚焦顯微鏡下拍照。

1.4 慢病毒感染BT549細胞

取生長狀態良好的BT549細胞,接種到6孔板(約1.5×105個細胞/孔),當細胞匯合度達30%時,分別感染陰性對照慢病毒(Con組)以及shRNA-RRS1慢病毒(sh-RRS1組),根據細胞的病毒感染復數值計算需要加入的病毒體積,將適量的病毒以及轉染試劑與1 mL的無血清DMEM培養基混勻,加入6孔板中,感染8～16 h后,更換為完全培養基繼續培養。感染72 h以后,于倒置熒光顯微鏡下觀察細胞熒光強度,當熒光強度達70%以上時進行后續實驗。

1.5 Western Blot實驗檢測細胞中RRS1蛋白表達量

當穩定生長的MDA-MB-468、MCF-7、BT-549、MDA-MB-231、MCF-10A細胞及慢病毒感染的兩組BT549細胞融合度達到80%～90%,吸棄原培養基,用PBS沖洗2次。加入含有10 g/L蛋白酶抑制劑和10 g/L磷酸酶抑制劑的RIPA緩沖液,在冰浴中裂解細胞30 min,收集細胞裂解液,用BCA法檢測蛋白濃度。將裂解得到的蛋白樣品加入適量的蛋白上樣緩沖液進行蛋白變性,根據蛋白濃度計算上樣體積。用含體積分數0.10的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,恒壓80 V直至各孔樣本穿過濃縮膠,然后調整為恒壓120 V繼續電泳。直至指示劑遷移至凝膠底部,然后300 mA恒流下將蛋白轉移到PVDF膜上。用50 g/L脫脂奶粉封閉2 h,并在4 ℃下與一抗孵育過夜。用TBST洗膜3次,每次10 min,然后放置搖床上常溫孵育二抗1 h,TBST洗膜3次,每次10 min。加入ELC顯色液顯影拍照。以GAPDH為內參,使用Image J軟件計算目的蛋白相對表達量。

1.6 RT-qPCR檢測細胞中RRS1 mRNA的表達

使用Trizol試劑提取穩定感染的Con組和sh-RRS1組細胞總RNA,檢測并調整濃度,確保兩組濃度一致,每次反應使用1 μg總RNA,通過反轉錄合成第一鏈cDNA,按照試劑說明書要求進行RT-qPCR,以GAPDH基因為內參,以2-△△CT法計算RRS1 mRNA的相對表達量。引物序列見表1。

表1 RT-qPCR引物名稱及其序列

1.7 CCK8實驗檢測細胞的增殖能力

將Con組和sh-RRS1組細胞,接種到96孔板(約2×103個細胞/孔)。分別于接種后第1、2、3、4、5天的10:00,將10 μL CCK8試劑與90 μL培養基混合,加入到有細胞的每個孔中,繼續孵育2 h,并使用酶標儀在波長450 nm處檢測各組細胞的吸光度值。

1.8 集落形成實驗檢測細胞的增殖能力

將Con組和sh-RRS1組細胞,分別接種于6孔板(約1×103個細胞/孔),每2～3 d根據細胞狀態進行換液培養。培養14 d或每個克隆均包含50個細胞以上時,菌落用40 g/L甲醛固定,PBS沖洗2次,然后向每個孔中加入5 g/L的結晶紫500 μL染色30 min。用PBS洗凈后自然晾干,拍照并進行計數分析。

1.9 細胞劃痕實驗檢測細胞的遷移能力

將Con組和sh-RRS1組細胞,分別接種于6孔板中(約2×105個細胞/孔),待細胞融合度達90%以上且細胞為單層狀態后,使用200 μL移液器吸頭稍微刮擦單層, 形成均勻的無細胞傷口區域,向每孔中加入2 mL無血清培養基,分別在培養第0、12、24 小時時用倒置顯微鏡拍照,計算第24小時時細胞遷移情況。

1.10 Transwell實驗檢測細胞的侵襲能力

將Con組和sh-RRS1組細胞以每孔約2×105個細胞接種至小室中,加入含30 μL基質凝膠(1∶8稀釋)的無血清培養基,并且確保小室的終體積為200 μL,下室加入600 μL含體積分數0.15血清的培養基,培養24～48 h后,用棉簽擦去小室內的細胞,并將底部的侵襲細胞固定染色,用PBS清洗后自然晾干,在光學顯微鏡下成像并計數。

1.11 Western Blot 實驗檢測細胞中AKT-mTOR相關信號通路蛋白的表達量

當Con組和sh-RRS1組培養的細胞融合度達到80%～90%時,吸棄原培養基,用PBS沖洗2次,用RIPA緩沖液裂解兩組細胞的總蛋白,BCA法檢測蛋白濃度。采用Western Blot方法檢測兩組細胞中AKT、m-TOR、p-AKT、p-mTOR、VEGF以及HIF-1α蛋白的相對表達量,實驗步驟同1.5。以GAPDH為內參蛋白計算目的蛋白的相對表達量。

1.12 統計學處理

2 結 果

2.1 乳腺癌細胞系中RRS1表達量比較

Western Blot實驗的結果顯示,正常MCF-10A與乳腺癌細胞系MDA-MB-468、MCF-7、MDA-MB-231、BT549細胞中的RRS1蛋白相對表達量分別為0.27±0.07、0.79±0.03、1.22±0.06、1.05±0.06、1.28±0.10。各組間比較差異有顯著性(F=48.92,P<0.05),其中4種乳腺癌細胞系中RRS1表達量顯著高于MCF-10A細胞系(P<0.05),4種乳腺癌細胞系之間比較差異無顯著性(P>0.05)。

2.2 RRS1在BT549細胞中的定位

免疫熒光染色顯示,RRS1主要在BT549細胞的細胞核和核仁表達,細胞質也有少量表達。見圖1。圖中綠色熒光染色的為RRS1。

圖1 RRS1在BT549細胞中的定位(免疫熒光染色,400倍)

2.3 慢病毒感染BT549細胞后RRS1表達量比較

Con組細胞中RRS1 mRNA和蛋白的相對表達量分別為1.01±0.01、0.91±0.04,sh-RRS1組分別為0.27±0.04、0.51±0.02。兩組細胞中RRS1 mRNA和蛋白表達量比較差異均具有顯著性(t=32.04、15.09,P<0.05)。證明RRS1敲降成功。

2.4 RRS1對BT549細胞增殖能力的影響

實驗結果顯示,時間、組別以及時間組別交互作用對細胞增殖能力均具有顯著影響(F時間=497.30,F組別=3 341.00,F交互=66.87,P<0.05)。單獨效應分析顯示,兩組細胞不同時間點細胞增殖能力比較差異具有顯著性(F=458.40、323.00,P<0.05),其中,與第1天相比,Con組和sh-RRS1組細胞其他時間點細胞增殖能力均明顯增強(P<0.05);與Con組相比,sh-RRS1組細胞在第4、5天的增殖能力明顯減弱(F=1 368.00、2 699.00,P<0.05),見表2。集落形成實驗結果顯示,Con組和sh-RRS1組集落形成數目分別為60.00±3.00、29.00±3.00,兩組相比較差異均具有統計學意義(t=14.86,P<0.05)。

表2 兩組細胞的細胞增殖能力比較

2.5 RRS1對BT549細胞遷移和侵襲能力的影響

細胞劃痕實驗結果顯示,Con組和sh-RRS1組細胞從0 h至24 h的遷移率分別為0.48±0.05、0.19±0.02,兩組細胞的遷移能力比較差異具有顯著性(t=9.06,P<0.05)。Transwell實驗結果顯示,Con組和sh-RRS1組細胞遷移通過小室的數目分別為103.33±7.09、29.67±7.63,兩組細胞遷移通過小室的數目比較差異具有顯著性(t=12.24,P<0.05)。見圖2。

A:Con組,B:sh-RRS1組;結晶紫染色,200倍

2.6 RRS1對侵襲和遷移相關蛋白表達的影響

Western Blot實驗結果顯示,與Con組相比,sh-RRS1組細胞中AKT、mTOR蛋白相對表達量比較差異無顯著性(P>0.05),p-AKT、p-mTOR、VEGF、HIF-1α蛋白相對表達量比較差異均有顯著性(t=6.29～22.86,P<0.05)。見表3。

表3 兩組細胞中AKT-m-TOR通路相關蛋白的表達量比較

3 討 論

近年來,中國乳腺癌新發病例數呈不斷升高趨勢［11］,每年有超過16.9萬女性患有乳腺癌［12］。盡管在治療干預方面取得了一定進展,但大約有30%的早期乳腺癌患者會發生轉移,5年相對生存率約為25%［13］。乳腺癌轉移過程極其復雜,其發病機制尚未闡明。因此,更全面地了解乳腺癌發生和進展的潛在機制,尋找更有效的新的治療靶點,對提高乳腺癌患者的生存率非常重要［14］。

RRS1是核糖體生物發生的調節因子［3］。人類RRS1基因位于染色體8q13.1上,僅包含一個外顯子［3］。RRS1在核糖體生物合成、赤道板染色體聚集和細胞周期端粒聚集中起重要作用［15-16］。RRS1通過促進內質網應激在亨廷頓病的發病機制中起重要作用［17-18］。近幾年,RRS1基因在腫瘤中的作用逐漸受到關注。GAMBE等［15］發現RRS1蛋白有助于HeLa細胞的染色體聚集。WU等［5］發現,在結直腸癌細胞中,敲降RRS1基因通過阻滯G2/M期進展和血管生成,進而抑制結直腸癌細胞增殖和腫瘤發生。MA等［7］的研究發現在胃癌細胞中敲降RRS1基因可誘導凋亡并可抑制細胞增殖、遷移和侵襲。YAN等［19］發現在視網膜母細胞瘤細胞中,敲降RRS1基因可通過AKT/mTOR信號通路促進細胞的增殖和侵襲。由此可以推測,RRS1基因與腫瘤的發生發展密切相關。本課題組前期利用TCGA數據庫結合高內涵篩選技術篩選出與乳腺癌細胞增殖和侵襲轉移有關的RRS1基因,并首次報道了RRS1在乳腺癌細胞增殖中的作用［8-9］。但目前關于RRS1基因與乳腺癌相關研究仍較少。

為了探索RRS1在乳腺癌細胞中的潛在作用,本研究首先使用Western Blot實驗分析比較RRS1在MDA-MB-231、MDA-MB-468、BT549、MCF-7乳腺癌細胞系和正常乳腺上皮MCF-10A細胞系中的表達量,結果顯示這4種乳腺癌細胞系的RRS1蛋白表達量顯著高于正常乳腺上皮細胞系MCF-10A。進一步選擇RRS1高表達的BT549細胞以求明確RRS1在乳腺癌細胞中的表達位置。免疫熒光染色顯示,RRS1主要在BT549細胞的細胞核和核仁表達,細胞質也有少量表達。為進一步探討RRS1基因在乳腺癌細胞中作用機制,本研究使用shRNA-RRS1慢病毒感染了BT549細胞,RT-qPCR以及Western Blot實驗檢測慢病毒對RRS1基因的敲降效果,結果顯示敲降RRS1基因顯著降低了BT549細胞RRS1 mRNA和蛋白的表達量。進一步研究顯示,敲降RRS1抑制了BT549細胞的增殖、遷移和侵襲能力。這些結果均提示RRS1在乳腺癌細胞的發生發展中起到了重要作用。

AKT/mTOR通路是一種經典的信號通路,對細胞增殖、代謝和運動等調控至關重要［20］。AKT/mTOR通路在多種癌癥中處于異常的高激活狀態,且與臨床的不良預后有關,在腫瘤細胞轉移、血管新生等方面發揮有關鍵作用［21-22］,同時其異常激活還會促進乳腺癌細胞的轉移和糖酵解,干預該通路的激活對于乳腺癌治療提供了新的思路［23］。因此,本研究進一步分析了RRS1對該通路的調控作用,敲降RRS1基因不影響AKT、mTOR的總蛋白水平,但可以明顯抑制BT549細胞AKT、mTOR蛋白的磷酸化水平,提示RRS1基因很可能直接或間接激活AKT/mTOR相關信號通路。血管生成對于惡性腫瘤的生長、轉移以及預后均具有極其重要的意義［24］。HIF-1α是調節血管生成的重要因子,能夠促進VEGF的表達［25］。由于Akt/mTOR通路是一種調節HIF-1α、VEGF蛋白表達的經典通路,所以進一步探討RRS1是否通過調控AKT/mTOR通路影響下游HIF-1α、VEGF蛋白的表達。本研究發現敲降RRS1基因通過抑制AKT/mTOR的激活,抑制了下游HIF-1α、VEGF蛋白的表達,進而抑制了BT549細胞的增殖和遷移。

綜上所述,RRS1在乳腺癌細胞中高表達,在細胞核和胞漿都有定位,敲降RRS1通過抑制AKT/mTOR信號通路及其下游蛋白的表達,進而抑制乳腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力。因此,RRS1可能是乳腺癌潛在的治療靶點。然而,該研究僅限于細胞水平,后續還需要對相關機制進行更深入和更全面的探討。

作者聲明：吳清蘭、鄧林、張金平、侯琳、孫文靜和張麗參與了研究設計;吳清蘭、侯琳和張金平參與了論文的寫作及修改。所有作者均閱讀并同意發表該論文,且均聲明不存在利益沖突。