PBMC中PPARγ、CD68和CD163表達水平在乳腺疾病診斷中的價值

錢世寧,張 潔,朱小飛

南京中醫藥大學附屬醫院醫學檢驗科,江蘇南京 210029

乳腺癌是女性常見惡性腫瘤之一,近年來其在我國的患病率呈上升趨勢,現已居于女性惡性腫瘤首位。目前,臨床上乳腺癌的早期診斷主要依靠B超、核磁和鉬靶等影像學手段,臨床實驗室指標和組織穿刺等病理學手段均不能在乳腺癌的早期發現和診斷中發揮良好作用。因此,尋找和建立一種能早期預測和診斷乳腺癌的方法顯得尤為重要。過氧化物酶增殖物激活受體(PPAR)是Ⅱ型核激素受體超家族的成員之一,屬于配體依賴的轉錄因子[1]。研究證明[2],PPARγ在乳腺癌的發生發展過程中起重要作用,其經配體激活后可有效抑制腫瘤細胞增殖,誘導腫瘤細胞分化和凋亡,抑制腫瘤血管侵襲,降低腫瘤細胞的侵襲力。腫瘤相關巨噬細胞(TAMs)是外周循環血液中的單核細胞在腫瘤來源的細胞因子和趨化因子作用下遷移到腫瘤微環境中增殖、分化形成的[3]。TAMs根據功能和狀態不同分為經典活化的巨噬細胞(M1型)和替代活化的巨噬細胞(M2型)。M1型巨噬細胞高表達促炎因子并激活免疫細胞,殺傷吞噬微生物和腫瘤細胞,并將產生的毒素中間體提呈給T細胞;而M2型巨噬細胞產生大量細胞因子,如:IL-10及轉化生長因子-β(TGF-β)等抑制機體免疫反應,促進腫瘤進展。有研究表明[4],TAMs進入腫瘤微環境后誘導形成M2型巨噬細胞,TAMs通過分泌和調控多種細胞因子,促進乳腺癌細胞分裂和轉移、癌血管生成以及淋巴管的生成,已逐漸成為乳腺癌研究的新靶點。CD68是巨噬細胞的經典標志物之一,已被廣泛用于標志實質性腫瘤浸潤的TAMs中,主要識別M1型巨噬細胞[5],而CD163在乳腺癌M2型巨噬細胞中高表達,可作為M2型標志物[6]。既往研究表明,TAMs的檢測可作為判斷乳腺癌侵襲轉移及臨床預后的重要指標[7]。本文通過檢測CD68和CD163在乳腺疾病患者外周血單個核細胞(PBMC)中的表達差異性,闡明TAMs相關分子標志在乳腺良惡性疾病診斷中的價值。孕激素受體(PR)是目前乳腺癌免疫組織化學的重要指標之一,作為乳腺癌診斷和判斷預后的重要影響因素。本文研究PPARγ、CD68和CD163在乳腺疾病患者外周血PBMC中的表達差異,并結合三者與PR表達相關性,可以為臨床乳腺疾病的診療提供新思路。

1 資料與方法

1.1一般資料 根據臨床病例信息收集2018年1月至2020年12月于本院因乳腺疾病就診的患者及健康女性的EDTA抗凝外周血樣本共47例,均為女性,平均年齡43.2歲。其中經病理學確診為乳腺癌者33例,未經手術治療者13例,術后患者20例;乳腺纖維瘤患者6例,同期選取健康體檢女性33例,作為健康對照組,4組間年齡、性別等一般資料差異無統計學意義(P=0.13)。本研究涉及的病患數據和樣本均通過南京中醫藥大學附屬醫院倫理委員會批準。

1.2儀器與試劑 淋巴細胞分離液(上海新睿生物科技有限公司)、三氯甲烷、異丙醇溶液、75%乙醇、TRIzol Reagent(Invitrogen公司)、Prime ScriptTM反轉錄PCR試劑(大連寶生物工程有限公司),SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑(大連寶生物工程有限公司),PCR引物合成由大連寶生物工程有限公司完成;高速臺式離心機(北京白洋醫療器械有限公司)、恒溫培養箱(上海煜南儀器有限公司)、數顯恒溫水浴鍋(基隆)、恒溫混勻儀(杭州瑞誠儀器有限公司),ABI 7500實時熒光定量PCR儀(美國ABI公司),Eppendorf Bio Photometer Plus核酸蛋白測定儀(Eppendorf公司)。

1.3方法

1.3.1PBMC的分離 取新鮮EDTA抗凝外周血,吸取2 mL淋巴細胞分離液加入10 mL分離管中,混勻備用全血標本,沿分離管管壁緩慢加入到分離液上,1 500 r/min離心30 min,吸取灰白層即單個核細胞層至1.5 mL EP管中,再于高速冷凍離心機中13 000 r/min,4 ℃離心5 min,收集細胞沉淀于-80 ℃保存備用。

1.3.2RNA提取和qPCR檢測PPARγ、CD68、CD163的表達水平 使用Trizol試劑提取PBMC總RNA。通過qPCR方法檢測PPARγ、CD68、CD163的mRNA水平,引物序列如下。PPARγ,上游:5′-TGGAGTTCATGCTTGTGAAG-3′,下游:5′-GCA TTA TGAGACATCCCCAC-3′;CD68,上游:5′-TTCCCCTATGGACACCTCAG-3′,下游:5′-TTGTACTCCACCGCCATGTA-3′;CD163,上游:5′-AAAAAGCCACAACAGGTCGC-3′,下游:5′-CTTGAGGAAACTGCAAGCCG-3′。采用2-ΔΔCt法計算相對表達水平。

1.3.3收集CEA和CA153檢測數據 從醫院的電子病歷系統中收集乳腺癌患者術前、術后及乳腺纖維瘤患者CA153檢測結果。

2 結 果

2.1CEA和CA153在良惡性乳腺疾病中表達水平的比較 本文比較了CEA和CA153這兩種腫瘤標志物在乳腺癌術前、術后和乳腺纖維瘤患者三組之間的表達水平。CEA在乳腺癌術前組較術后組表達水平(P=0.31),在乳腺癌術后組較乳腺纖維瘤組表達水平(P=0.22),在乳腺癌術前組較乳腺纖維瘤組表達水平(P=0.74),差異均無統計學意義;同樣,CA153在乳腺癌術前組較術后組表達水平(P=0.67),在乳腺癌術后組較乳腺纖維瘤組表達水平(P=0.58),在乳腺癌術前組較乳腺纖維瘤組表達水平(P=0.82),差異均無統計學意義。見圖1。CEA和CA153不能作為乳腺疾病鑒別診斷和預后判斷的有效指標。

圖1 CEA和CA153在乳腺癌術前、術后和乳腺纖維瘤患者中的表達。

2.2PPARγ、CD68和CD163在乳腺癌術前、術后和乳腺纖維瘤患者之間的表達水平和差異 本研究檢測了PPARγ、CD68和CD163在健康對照人群,乳腺癌術前、術后患者和乳腺纖維瘤患者樣本中的表達水平,以健康對照人群的表達水平作為基準。與健康對照人群相比,乳腺癌術前患者的PPARγ表達顯著降低(P<0.001),而乳腺纖維瘤患者的PPARγ表達則明顯增高(P<0.05)。不僅如此,PPARγ在乳腺癌術后患者樣本中的表達明顯增高,與乳腺癌術前患者比較差異有統計學意義(P<0.01)。CD68在三組之間的表達水平和差異與PPARγ相似。除此之外,CD163在三組之間的表達也存在差異。其中,CD163在乳腺癌術前患者的表達水平最高,顯著高于健康對照組(P<0.05)、術后組(P<0.05)和乳癌纖維瘤組患者(P<0.05)。見圖2。上述結果提示,PPARγ、CD68和CD163可能是鑒別乳腺疾病良惡性和預后判斷的潛在指標。

圖2 PPARγ、CD68和CD163在健康對照、乳腺癌術前、術后和乳腺纖維瘤患者中的表達水平和差異情況

2.3ROC分析PPARγ、CD68和CD163對乳腺癌的診斷效率 PPARγ在乳腺癌術前、術后和乳腺纖維瘤患者中的ROC曲線分析顯示,ROC曲線下面積分別為0.89、0.93和0.93,臨界值分別為0.77、1.08和0.78,靈敏度分別為88.89%、80.00%和85.71%,特異度分別為87.50%、87.50%和88.89%。CD68在乳腺癌術前、術后和乳腺纖維瘤患者中的ROC分析顯示,ROC曲線下面積分別為0.79、0.83和0.90,臨界值分別0.77、1.08和1.16,靈敏度分別為77.78%、80.00%和57.14%,特異度分別為87.50%、87.50%和88.89%;CD163在乳腺癌術前、術后和乳腺纖維瘤患者中的ROC分析顯示,ROC曲線下面積分別為0.86、0.54和0.85,臨界值分別為1.08、1.08和1.28,靈敏度分別為77.78%、33.33%和85.71%,特異度分別為87.50%、87.50%和77.78%。根據ROC曲線分析的結果,PPARγ在乳腺癌和乳腺纖維瘤中均具有較高的靈敏度和特異度,診斷效能較高;而CD68對于乳腺癌和乳腺纖維瘤的診斷均具有較高的特異度,在乳腺癌中也具有較高靈敏度,但對于乳腺纖維瘤的診斷靈敏度較低;CD163在乳腺癌和乳腺纖維瘤診斷中的特異度較高,但對乳腺癌術后患者的靈敏度過低。因此,PPARγ、CD68和CD163在乳腺癌和乳腺纖維瘤的鑒別診斷和預后判斷中具有一定作用。

2.4PPARγ、CD68和CD163表達水平與乳腺癌組織中PR表達的相關性分析 乳腺癌患者PBMC中PPARγ表達水平與癌組織中PR的表達呈正相關(r=0.92,P<0.001);CD68表達水平與癌組織中PR的表達也呈正相關性(r=0.96,P<0.001);而CD163表達水平與癌組織中PR的表達呈負相關(r=0.91,P<0.001)。上述結果表明,PPARγ、CD68和CD163表達水平與乳腺癌組織中PR的表達存在著相關性,提示三者可能作為乳腺癌診斷和判斷預后的潛在指標。見圖3。

注:左、中、右依次為PPARγ、CD68和CD163表達水平與PR的相關性分析。

3 討 論

過氧化物酶增殖物激活受體(PPARs)根據結構特征分為三種亞型:PPARα、PPARβ、PPARγ,其中PPARγ是研究最多的亞型[2]。PPARγ經與配體結合后激活,從而與維A酸類X受體(RXR-α)形成異源二聚體,入核與目標基因的過氧化物酶體增殖體反應元件(PPRE)結合,激活目的基因轉錄,引起相應的生物學效應[8]。有實驗研究證明[9],PPARγ激動劑羅格列酮(ROZ)可抑制乳腺癌細胞(MCF-7)增殖并誘導其凋亡。江穎等[1]實驗證明PPARγ與TNM分期、腫瘤組織學分級呈負相關,PPARγ在良性乳腺組織中的表達強度高于乳腺癌組織。這些發現與本實驗中觀察到的PPARγ在乳腺纖維瘤患者PBMC中表達水平高于乳腺癌患者的現象一致。另多項研究證明[1,10-12],PPARγ與PR表達呈正相關,其高表達與乳腺癌患者總生存率正相關,是預后良好的重要指標。本文同樣也觀察到乳腺癌患者PBMC中PPARγ的表達水平與癌組織中PR的表達存在著正相關性,說明患者外周血PBMC中的PPARγ同樣能夠反映腫瘤本身的特性。

TAMs與腫瘤的發生和進展存在相關性。既往研究顯示[3,13-16],TAMs在乳腺癌中的浸潤程度與腫瘤分級、激素狀態有關。良性乳腺疾病中TAMs的浸潤密度明顯低于其在乳腺癌組織中的密度,提示TAMs可能具有用于乳腺癌診斷篩查的潛在價值。TAMs主要包括M1和M2兩種類型的巨噬細胞,其中M1型巨噬細胞可表達促炎因子并激活免疫細胞,具有增強免疫反應和殺傷腫瘤細胞的功能;而M2型巨噬細胞主要產生抑制性細胞因子抑制免疫反應,促進腫瘤進展。由于腫瘤血供和機體血流存在著聯通交換的病理特征,因此外周血中的PBMC可能通過腫瘤血供進入腫瘤微環境轉化成為M2型巨噬細胞,促進腫瘤進展;而另一方面腫瘤微環境中的TAMs也可能通過血流途徑進入外周循環,從而使得通過監測外周血PBMC的極性狀態預測腫瘤發生發展成為可能。本文首次通過檢測外周血PBMC中TAMs標志分子CD68和CD163的表達水平,同樣發現了CD68和CD163分子在健康人群、乳腺癌患者和良性乳腺纖維瘤患者之間的顯著差異,并通過ROC曲線分析提示兩種分子對乳腺癌和乳腺纖維瘤患者具有較高的診斷效率。值得注意的是,CD68在乳腺癌患者PBMC中的表達水平顯著低于其在正常組織和良性乳腺疾病組織中的水平,可能原因在于PBMC由單核巨噬細胞和淋巴細胞等單個核細胞組成,乳腺癌患者外周循環池中的單核巨噬細胞被腫瘤細胞招募至腫瘤微環境極化形成M2型巨噬細胞參與腫瘤進展[17-18],從而導致外周PBMC中CD68相對表達水平降低。

除此之外,TAMs還與腫瘤組織中ER、PR和Her2等受體表達有關[19]。盡管PR作為單獨指標對乳腺癌診斷價值不大,與患者年齡、腫瘤體積、有無淋巴結轉移、腫瘤分期及組織學類型的差異也無統計學意義,但其與ER、p53及c-erbB-2等聯合檢測可用來指導臨床用藥和預后判斷[20]。本實驗結果表明外周血PBMC中CD68和CD163分別與乳腺癌組織中PR表達呈正、負相關性,因此可將CD68和CD163納入早期聯合診斷指標之中,提高乳腺癌診斷的準確性。

本文同時研究PPARγ和TAMs相關標志在乳腺良惡性疾病中的表達及診斷價值是基于二者在乳腺疾病中作用機制的共通之處。研究表明:M2型巨噬細胞受低氧刺激分泌VEGF,誘導血管生成并招募更多的巨噬細胞至腫瘤微環境[4],以正反饋方式調控腫瘤微環境的血管生成,而PPARγ配體15d-PGJ2等能有效抑制腫瘤細胞VEGF及其受體表達,從而抑制腫瘤血管生成[21]。在對乳腺癌細胞的增殖、分化和侵襲的調控方面,TAMs可被MCF-7刺激分泌大量IL-6,經JAK2-STAT3通路活化后,增加靶基因TGF-β1、HIF-1a轉錄,激活癌干細胞,促進腫瘤生長和轉移[22],而配體介導的PPARγ激活可阻滯TAMs向M2型巨噬細胞轉化,抑制M2型“促癌”作用發揮[22-23]。種種跡象表明,PPARγ在TAMs極化過程中發揮了重要作用。因此本實驗聯合檢測TAMs分子標志(CD68和CD163)以及PPARγ在乳腺良惡性疾病中的表達,并且發現PPARγ表達水平與TAMs極化狀態存在密切關聯。

綜上所述,本文研究了外周血PBMC中PPARγ和TAMs標志分子(CD68和CD163)在乳腺疾病患者的差異性表達,初步探討了三種分子與腫瘤組織PR表達的相關性,為臨床乳腺疾病的診斷和預后判斷提供了新方法和新思路。