水稻溫敏型葉色突變體tsa58的變異檢測及轉錄組分析

陳能剛, 鄢小青, 李 歡, 楊占烈, 吳榮菊, 陳 鋒

(貴州省農業科學院農作物品種資源研究所, 貴陽 550006

水稻是重要的糧食作物,新種質的創制是提高水稻產量的重要前提,而60Co輻射誘變技術是種質創制的重要技術手段之一。60Co輻射誘變通過染色體數目、染色體結構或DNA的核苷酸變異而引起表型特征變化[1]。隨著生物信息技術的高速發展,通過全基因組測序技術可以更高效率和低成本對輻射誘變獲得的新種質進行全基因組的變異檢測分析,從而發掘新的基因。

制約水稻產量的因素很多,其中光合作用是最重要的因素之一。葉綠體是光合作用的重要場所,其發育狀態直接影響水稻葉片的光合作用。葉色突變體是研究葉綠體發育和光合色素合成降解機制的理想材料。水稻葉色突變性狀也可作為標記性狀,在雜交稻育種和高光效育種中具有重要應用價值。其中轉綠型葉色突變體具有階段性特異表達,轉綠后對主要農藝性狀影響較小等優點,因此可作為標記性狀用于水稻雜交育種和種子生產中。進一步發掘和鑒定新的轉綠型葉色突變基因,加強利用轉綠型葉色標記不育系的選育,有助于揭示水稻葉色突變的分子機理和探討轉綠型葉色突變體在水稻生產實踐中有效應用。目前已經克隆了參與光合色素合成的基因,這些基因突變均會引起葉色變化。如OsCAO1編碼葉綠素a加氧酶,其突變體表現出淡綠葉的表型[2]。OsCHLH、OsCHLD和OsCHLI分別編碼Mg-原卟啉IX螯合酶的3個亞基,突變植株均表現為葉片黃化[3-4]。YGL1編碼葉綠素合酶,催化葉綠素酸酯a轉化為葉綠素a,突變體表現為黃綠葉[5]。同時也克隆了很多影響葉綠體發育的基因,如WSL3編碼一個質體RNA聚合酶的非核心亞基OsPAP1/OspTAC3,其突變體表現為白化致死[6]。OspTAC2編碼一個含有10個PPR結構域的葉綠體蛋白,OspTAC2突變植株表現為白化致死,PEP活性嚴重受損[7]。這些基因從不同途徑參與調控植株的光合色素合成和葉綠體發育。

本研究利用60Co輻射誘變貴州地方粳稻種質資源“橋港珍珠米”,在后代分離中獲得的一個能夠穩定遺傳的溫敏型葉色突變體tsa58。本研究結合變異檢測和轉錄組分析確定tsa58的候選基因,為深入研究該基因的分子機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

本試驗的材料是貴州地方粳稻種質資源“橋港珍珠米”通過60Co輻射誘變后獲得的能夠穩定遺傳的溫敏型葉色突變體,暫命名為tsa58[8]。

1.2 不同溫度處理

分別在20 ℃和30 ℃光照培養箱中(12 h光照/12 h黑暗)培養,同時種植試驗材料突變體tsa58及其野生型(WT),萌發20 d后,觀察幼苗表型,并進行光合色素測定。

1.3 光合色素測定

選擇在20 ℃和30 ℃條件下萌發后20 d的野生型和突變體tsa58幼苗的全展葉取樣,分別稱取新鮮葉片0.2 g進行光合色素含量測定,按鄢小青等[8]的方法計算葉片單位鮮重的葉綠素和胡蘿卜素含量。

1.4 全基因組變異檢測分析

全基因組變異檢測分析由北京諾禾致源公司完成。1) 采用CTAB法分別提取突變體tsa58與野生型的DNA,DNA樣品待檢驗合格后利用Covaris破碎機隨機打斷成長度為350 bp的片段。2) 采用TruSeq Library Construction Kit進行建庫,文庫構建完成后,使用Qubit 3.0軟件進行初步定量,使用Q-PCR方法對文庫的有效濃度進行準確定量,保證文庫質量。3) 庫檢合格后進行illumina測序。測序獲得的有效測序數據通過BWA軟件比對到參考基因組,比對結果經SAMTOOLS法去除重復。4) 采用SAMTOOLS法進行個體SNP和長度小于50 bp的小片段插入與缺失檢測分析(InDel)。5) 利用BreakDancer軟件,檢測樣品與參考基因組間的插入(insertion,INS)、缺失(deletion,DEL)、倒置(inversion,INV)、染色體內部遷移(intra-chromosomal translocation,ITX)、染色體間的遷移(inter-chromosomal translocation,CTX),通過ANNOVAR軟件對DEL、INS、INV進行變異注釋。6) 利用CNVnator判斷潛在的deletion和duplication,并通過ANNOVAR進行變異注釋。

1.5 轉錄組分析

轉錄組分析由北京諾禾致源公司完成。1) 突變體tsa58和野生型幼葉的總RNA采用天根RNA提取試劑盒(RNA Prep Pure PlantKit)提取,分別用瓊脂糖電泳和Nanodrop檢測RNA的完整性和純度,然后利用Qubit 2.0熒光定量儀對RNA濃度進行精確定量,采用Agilent 2100精確檢測RNA的完整性,保證提取的RNA達到建庫要求。2) RNA樣品檢測合格后進行建庫,文庫構建完成后,先使用Qubit 2.0進行初步定量,稀釋文庫,隨后使用Agilent 2100對文庫的插入片段大小進行檢測,插入片段符合預期后,使用Q-PCR方法對文庫的有效濃度進行準確定量,以保證文庫質量。3) 文庫檢測合格后,按照有效濃度及目標下機數據量的需求將不同文庫pooling至flowcell,cBOT成簇后使用Illumina高通量測序平臺NovaSeq 6000進行測序。4) 待測序完成后進行基因表達量分析和差異表達分析,表達差異基因通過GO聚類分析,根據差異基因在分子功能、生物學過程和細胞組分上的分布,篩選不同的GO term進行分析。

2 結果與分析

2.1 不同溫度條件下水稻溫敏型葉色突變體tsa58的表型特征

試驗中發現,在20 ℃和30 ℃的光照培養箱中萌發的20 d秧齡突變體tsa58的幼苗間存在葉色差異。在20 ℃條件下,tsa58葉片呈現完全白化(圖1 A);在30 ℃條件下,tsa58葉色與野生型無明顯差異(圖1 B)。進一步對不同溫度處理的野生型和tsa58的光合色素進行測定發現,與野生型相比,在20 ℃條件下,tsa58葉片的總葉綠素、葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量降低幅度最大,均達到極顯著差異水平,分別降至野生型的12.95%,12.69%,13.76%和18.27%(圖1 C);在30 ℃條件下,與野生型相比,tsa58葉片的總葉綠素、葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量均與野生型無顯著差異(圖1 D)。

注:“*”表示p<0.05差異顯著。圖1 野生型(WT)和突變體tsa58在20 ℃和30 ℃條件下的表型特征Fig.1 Phenotypic characteristics of the wild type (WT) and mutant tsa58 at 20 ℃ and 30 ℃

2.2 tsa58變異檢測分析

2.2.1測序數據質量匯總

通過測序數據分析,本次測序共產生原始數據35.5 Gb,過濾后有效數據為35 Gb,GC含量在44.32%～44.52%之間。所有樣本的數據量足夠,測序質量合格,GC分布正常,建庫測序成功。本研究以粳稻日本晴作為參考基因組,參考基因組大小為375 049 285 bp,所有樣本的比對率在96.67%～99.16%之間,對參考基因組(排除N區)的平均覆蓋深度在33.32 X～38.61 X之間,1 X覆蓋度(至少有一個堿基的覆蓋)在97.16%以上,可用于后續的變異檢測及相關分析(表1)。

表1 野生型和突變體tsa58測序數據Table 1 Sequencing data of the wild type and mutant tsa58

2.2.2變異檢測分析

SNP變異分析:采用SAMTOOLS進行個體SNP的檢測。野生型和tsa58分別獲得289 649個和295 492個SNPs,其中基因間的SNPs最多,分別為197 985個和202 215個。其次為內含子區域,分別為26 218個和26 624個。外顯子區域分別為15 552個和15 792個,其中非同義突變為主(表2)。

表2 SNPs分布區間及數目Table 2 Distribution interval and number of SNPs

InDels變異分析:利用SAMTOOLs檢測長度小于50 bp的小片段插入與缺失。結果顯示,在野生型和tsa58分別獲得60 268個和60 852個InDels,其中基因間區域最多,分別為35 989個和36 412個缺失片段。在外顯子區域中,以非移碼變異為主,其次是移碼變異(表3)。

表3 InDels分布區間及數目統計Table 3 Distribution interval and number statistics of InDels

結構變異(SV)分析:結構變異是指基因組結構變異是水平上大片段的插入、缺失、倒置、易位變異。可利用BreakDancer[5]軟件,基于pair-end reads比對到參考基因組上面的關系及實際大小檢測樣品與參考基因組間的插入、缺失、倒置、染色體內部遷移、染色體間的遷移。野生型和tsa58分別獲得8 207個和7 971個結構變異,其中外顯子區域分別獲得897個和914個(表4)。

表4 結構變異分布區間及數目統計Table 4 Distribution interval and number statistics of structure variation

拷貝數變異(CNV)分析:拷貝數變異指基因組片段的拷貝數增加或者減少。通過CNVnator分析在野生型和tsa58中分別檢測到4 722個和4 978個烤貝數變異。主要分布在基因間區域,分別為3 328個和3 463個。其次是外顯子區域,分別為588個和649個。野生型拷貝數增加1 381個,減少3 341個,增加長度為10 066 000 bp,減少長度為19 394 800 bp。tsa58的拷貝數增加1 386個,減少3 592個,增加長度為10 292 100 bp,減少長度為19 784 100 bp(表5)。

表5 拷貝數變異分布區間及數目統計Table 5 Distribution interval and number statistics of copy number variation

2.2.3候選基因分析

本研究通過變異檢測分析,發現位于2號染色體上的20878044～21473236間發生了倒置結構變異(表6),其位點21473236位于Os02g0565400(LOC_Os02g35750)的外顯子上,導致該基因翻譯提前終止(圖2)。在20 ℃條件下轉錄組分析發現,該基因在野生型和突變體tsa58中的表達量無顯著差異,但在該基因的可變剪接類型存在差異。在野生型中存在TSS、TTS、AE等3種剪接類型,同時存在5個不同的剪接位點,而突變體tsa58未檢測到可變剪接(表7)。推測可能是由于該突變位點發生INV變異導致該基因的可變剪接類型發生變化,從而影響該基因的功能。

表6 在突變體tsa58中外顯子區域發生INV變異的類型Table 6 Types of INV variation in exon region of the tsa58

表7 野生型中Os02g0565400(LOC_Os02g35750)的可變剪接類型Table 7 Variable splicing types of Os02g0565400 (LOC_Os02g35750) in wild type

注:紅箭頭為發生INV變異位點。圖2 Os02g0565400(LOC_Os02g35750)結構圖Fig.2 Structure diagram of Os02g0565400 (LOC_Os02g35750)

2.3 突變體tsa58與野生型在低溫條件下轉錄組分析

2.3.1重復相關性評估和樣品基因表達量總體分布

本研究在實驗設計中20 ℃處理野生型(C 1)和突變體tsa58(T 1),每個樣品設計3次生物學重復。如圖3所示,樣品兩兩之間相關性均大于0.9。說明本試驗各重復樣品間的誤差率低,重復性較好,可用于后續分析研究。

圖3 兩個樣品的表達量相關性Fig.3 Correlation of expression levels between the two samples

2.3.2突變體tsa58與野生型在不同溫度下差異表達分析

對于有生物學重復的樣本,DEseq 2適用于進行樣品組間的差異表達分析,獲得突變體與野生型之間的差異表達基因集。在差異表達基因檢測過程中,將Fold Change≥2且FDR<0.01作為篩選標準。通過火山圖(Volcano Plot)可以快速地查看基因在兩個(組)樣品中表達水平的差異,以及差異的統計學顯著性。在20 ℃條件下,突變體tsa58與野生型間差異表達的基因有1 516個,其中上調的差異基因有980個,下調的差異基因有536個(圖4)。

圖4 差異表達火山圖Fig.4 Differentially expressed volcano map

2.3.3差異表達基因KEGG通路富集分析

將差異基因進行GO功能分析,共有980個差異基因分布在生物過程、細胞組分和分子功能等三個層面上。在生物過程方面,461個差異基因富集在代謝過程,有438個差異基因富集在細胞過程。在細胞組分方面,有503個差異基因主要富集在細胞和細胞器等。在分子功能方面,有480個差異基因主要富集在綁定,有355個差異基因主要富集在催化活性等(圖5)。

圖5 突變體tsa58與野生型間差異表達的基因Fig.5 Differentially expressed genes between the tsa58 and wild type

為了準確分析突變體與野生型體內代謝通路發生的變化,對差異基因顯著富集的20條KEGG生物通路進行統計分析。在20 ℃條件下差異基因顯著富集的通路主要是核糖體、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解、丙氨酸、天門冬氨酸和谷氨酸代謝、倍半萜和三萜生物合成、油菜素類固醇生物合成、光合作用、ABC轉運蛋白、堿基切除修復、苯并惡嗪類生物合成、類胡蘿卜素生物合成、半乳糖代謝、肌醇磷酸鹽代謝、植物-病原菌互作、卟啉和葉綠素代謝、RNA降解、RNA聚合酶、牛磺酸和次牛磺酸代謝、硫胺素新陳代謝、色氨酸代謝和維生素B 6代謝(圖6)。核糖體大小亞基差異基因為27個,由葉綠體基因組編碼的rps7、rpl32、rpl20和rps16均顯著下調。而在細胞核基因組編碼的基因中除OsRPL44顯著下調以外,其余基因均顯著上調(圖7)。

圖6 突變體tsa58與野生型間差異表達基因的KEGG通路富集散點圖Fig.6 Rich distribution site of KEGG pathway of differentially expressed gene between the tsa58 and wild type

圖7 突變體tsa58與野生型間葉綠體核糖體亞基中差異表達的基因Fig.7 Expression of ribosome subunit differential gene in chloroplast between the tsa58 and wild type

3 結論與討論

在本研究中,突變體tsa58在20 ℃條件下,幼苗葉片呈現完全白化,光合色素含量較野生型極顯著降低;而在30 ℃條件下,幼苗葉色呈現正常綠色,光合色素含量與野生型無明顯差異。研究結果表明tsa58為溫敏型葉色突變體。本研究通過變異檢測分析,發現在定位區間內的20878044～21473236間發生了倒置結構變異,其位點21473236位于Os02g0565400的外顯子上,導致該基因翻譯提前終止。結合野生型和突變體tsa58在20 ℃條件下轉錄組分析發現,該基因在野生型和突變體tsa58中的表達量無顯著差異,但該基因的可變剪接方式存在差異。該基因在野生型中存在TSS、TTS、AE等3種剪接類型,并存在5個不同的剪接位點,而在突變體tsa58中未檢測到可變剪接類型。因此可以推測tsa58為Os02g0565400(WSL4)的新等位突變體。

質體核糖體蛋白對質體蛋白的生物合成、核糖體的生物合成、早期葉綠體的發育及葉綠體的分化都非常重要。在20 ℃條件下的轉錄組分析結果表明,突變體tsa58在核糖體大小亞基差異基因為27個(圖7),其中由葉綠體基因組編碼的rps7、rpl32、rpl20和rps16均顯著下調,而由細胞核基因組編碼的基因中除OsRPL44顯著下調以外,其余基因均顯著上調。可以推測,tsa58基因突變導致葉綠體核糖體不能正常形成并組裝,導致植物在低溫條件下呈現出白化表型。tsa58(WSL4)為P類PPR蛋白成員主要參與RNA的剪接、穩定、切割和翻譯過程。WSL4通過影響合酶成員的剪接和翻譯,影響葉綠體中ATP的合成過程[9]。