從肝治心組方對氧糖剝奪/復灌H9c2心肌細胞模型鐵代謝的調節作用

曾陽 王瑾茜 陳亞 胡國恒 張程程 何飄 樸美虹

〔摘要〕 目的 研究大鼠心肌缺血/再灌注（myocardial ischemia/reperfusion， MI/R）損傷后心肌細胞的鐵代謝及從肝治心組方干預對鐵死亡的調節作用。方法 選擇體外培養的大鼠H9c2心肌細胞，并采用氧糖剝奪/復灌（oxygen glucose deprivation/reperfusion， OGD/R）法建立體外MI/R模型。將細胞分為正常組、模型組、中藥組、抑制劑組、激動劑組、聯合組、空白血清組。除正常組外，其余各組均予以OGD/R誘導損傷，在復灌時分別給予完全培養基、含15%含藥血清的高糖DMEM培養基、含鐵死亡抑制劑Ferrostatin-1（Fer-1）（0.5 μmol/L）的完全培養基、含愛拉斯汀（Erastin）（10 μmol/L）的完全培養基、含Erastin（10 μmol/L）的15%含藥血清培養基、含15%空白血清的高糖DMEM培養基。采用CCK-8檢測細胞存活率，TMRE熒光探針檢測線粒體膜電位，FerroOrange檢測細胞內Fe2+水平，DCFH-DA熒光探針檢測活性氧（reactive oxygen species， ROS）水平。結果 與正常組比較，模型組與空白血清組細胞存活率及線粒體膜電位顯著下降（P<0.01），Fe2+及ROS水平顯著升高（P<0.01）。模型組與空白血清組線粒體膜電位、Fe2+水平差異無統計學意義（P>0.05）。與模型組比較，中藥組及抑制劑組細胞存活率及線粒體膜電位顯著升高（P<0.01），Fe2+及ROS水平顯著降低（P<0.01）。中藥組與抑制劑組線粒體膜電位、Fe2+及ROS水平差異無統計學意義（P>0.05）。與模型組相比，激動劑組細胞存活率及線粒體膜電位顯著下降（P<0.01），Fe2+及ROS水平顯著升高（P<0.01）。與激動劑組相比，聯合組細胞存活率及線粒體膜電位顯著升高（P<0.01），Fe2+及ROS水平顯著降低（P<0.01）。結論 從肝治心組方可以減少MI/R損傷，其機制可能與調節心肌細胞鐵代謝、抑制鐵死亡有關。

〔關鍵詞〕 從肝治心組方;心肌細胞;鐵代謝;鐵死亡;氧糖剝奪/復灌;心肌缺血/再灌注損傷

〔中圖分類號〕R285.5? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2023.06.009

〔Abstract〕 Objective To investigate the iron metabolism of cardiomyocyte after myocardial ischemia-reperfusion （MI/R） injury in rats and the regulatory effects of Conggan Zhixin Compound Formula on ferroptosis. Methods H9c2 cardiomyocytes of rats cultured in vitro were selected and an in vitro MI/R model was established by oxygen glucose deprivation/reperfusion （OGD/R） modeling. The cells were divided into normal group， model group， Chinese medicine group， inhibitor group， agonist group， joint group， and blank serum group. Except for the normal group， all other groups were subjected to OGD/R induced injury. During reperfusion， complete medium， high-glucose DMEM medium containing 15% drug-containing serum， complete medium containing Ferrostatin-1 （0.5 μmol/L）， complete medium containing Erastin （10 μmol/L）， 15% drug-containing serum medium containing Erastin （10 μmol/L）， and high-glucose DMEM medium containing 15% blank serum were administered according to different groups. CCK-8 was used to measure cell survival rate， TMRE fluorescent probe was used to examine mitochondrial membrane potential， FerroOrange was used to determine intracellular Fe2+ level， and DCFH-DA fluorescent probe was used to identify reactive oxygen species （ROS） level in each group. Results Compared with the normal group， the cell survival rates and mitochondrial membrane potential in the model group and the blank serum group decreased significantly （P<0.01）， and the levels of Fe2+ and ROS increased significantly （P<0.01）. There was no significant difference in mitochondrial membrane potential and Fe2+ levels between the model group and the blank serum group （P>0.05）. Compared with the model group， the cell survival rates and mitochondrial membrane potential in the Chinese medicine group and the inhibitor group increased significantly （P<0.01）， and the levels of Fe2+ and ROS decreased significantly （P<0.01）. There was no significant difference in mitochondrial membrane potential， Fe2+ and ROS levels between the Chinese medicine group and the inhibitor group （P>0.05）. Compared with the model group， the cell survival rate and mitochondrial membrane potential in the agonist group decreased significantly （P<0.01）， and the levels of Fe2+ and ROS increased significantly （P<0.01）. Compared with the agonist group， the cell survival rate and mitochondrial membrane potential in the joint group were significantly higher （P<0.01）， and the levels of Fe2+ and ROS were significantly lower （P<0.01）. Conclusion Conggan Zhixin Compound Formula can reduce MI/R injury， and its mechanisms may be related to regulating iron metabolism of myocardial cells and inhibiting ferroptosis.

〔Keywords〕 Conggan Zhixin Compound Formula; cardiomyocyte; iron metabolism; ferroptosis; oxygen glucose deprivation/reperfusion; myocardial ischemia/reperfusion injury

近年來，我國心肌缺血性疾病發病率持續增高，急性心肌梗死已成為人類死亡的重要原因[1]。再灌注是治療心肌缺血的有效措施，但血供恢復后可能出現心肌損傷進行性加重，這種現象稱為心肌缺血/再灌注（myocardial ischemia/reperfusion， MI/R）損傷[2]。MI/R損傷是血運重建后造成心肌梗死范圍擴大、心律失常、猝死等嚴重后果的重要原因。因此，減輕血管重建后MI/R損傷成為治療心肌缺血性疾病的關鍵。研究表明，在MI/R損傷過程中，鐵死亡是一個重要的發病機制，靶向鐵死亡有望治療MI/R損傷[3]。鐵死亡是一種新型細胞死亡方式，以鐵超載導致細胞抗氧化能力耗竭、活性氧（reactive oxygen species，ROS）累積、脂質過氧化增加為主要特征[4-5]。因此，尋找有效藥物抑制MI/R損傷后心肌細胞鐵死亡，避免心肌損傷進一步加重，成為治療心肌缺血性疾病的新靶向。從肝治心組方（在心痛靈I號基礎上增加疏肝解郁之藥）為中藥復方，具有多成分、多靶點、多通路的特點，主要用于治療胸痹、心痛[6]。前期研究表明，從肝治心組方對缺血心肌具有保護作用[7-8]，其是否抑制鐵死亡進程尚未可知。本研究以大鼠H9c2心肌細胞為研究對象，從體外的角度探討從肝治心組方對心肌細胞鐵代謝是否具有調節作用，為MI/R損傷的中醫藥治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 細胞? 細胞株為大鼠H9c2心肌細胞（武漢普諾賽生命科技有限公司，批號：CL-0089）。將大鼠H9c2心肌細胞置于含10%胎牛血清、1%青鏈霉素混合液的培養基中，放入37 ℃、5% CO2的培養箱培養，24 h后換液。待細胞融合至80%～90%時，用0.25%胰蛋白酶消化，按1∶2傳代，達到基本融合后再次消化傳代，進行擴增和富集。

1.1.2? 動物? 12只Sprague-Dawley雄性大鼠，體質量250～280 g，SPF級，飼養于湖南中醫藥大學實驗動物中心，用于血清制備。動物購自湖南省斯萊克景達實驗動物有限公司，動物許可證號：SCXK（湘）2019-0004，動物質量合格證號：430727211100716862，動物倫理審批號：20201010-3。

1.1.3? 主要試劑? 胎牛血清、高糖DMEM培養基、0.25%胰蛋白酶溶液（含0.02% EDTA）（美國Gibco公司，批號：42G3099K、8121033、2185855）;無糖DMEM培養基（上海源培生物科技股份有限公司，批號：L210804）;PBS（武漢普諾賽生命科技有限公司，批號：WH01132103XP04）;青鏈霉素混合液（北京索萊寶科技有限公司，批號：P1400）;細胞增殖及毒性檢測試劑盒（北京博奧森生物技術有限公司，批號：BA02247076）;線粒體膜電位檢測試劑盒、ROS檢測試劑盒（碧云天生物技術有限公司，批號：051021210518、011521210429）;二價鐵離子檢測探針-FerroOrange[東仁化學科技（上海）有限公司，批號：SZ759]。

1.1.4? 主要儀器? 旋轉蒸發儀（德國Heidolph公司，型號：Hei-vapAdv antage）;CO2培養箱（美國賽默飛世爾科技公司，型號：Forma CO2 3111）;倒置生物顯微鏡（廣州粵顯光學儀器有限責任公司，型號：XDS-1）;多功能酶標儀（美國PerkinElmer公司，型號：EnSpire）;激光共聚焦顯微鏡（美國蔡司公司，型號：LSM800）。

1.2? 方法

1.2.1? 模型制備? 取大鼠H9c2心肌細胞構建氧糖剝奪/復灌（oxygen glucose deprivation/reperfusion， OGD/R）模型[9]。將大鼠H9c2心肌細胞接種于細胞板后，先用完全培養基（含10%胎牛血清的高糖DMEM培養基）進行常規培養（37 ℃，5%CO2）。24 h后選用無血清的低糖DMEM培養基替換完全培養基，并置于提前設置缺氧環境的三氣培養箱（37 ℃，1%O2，5% CO2，94%N2）中培養12 h，模擬氧糖剝奪環境。最后更換為完全培養基，置于37 ℃、5%CO2培養箱中復灌2 h。

1.2.2? 分組及給藥? 動物實驗分組及給藥：從肝治心組方由紅參10 g、當歸10 g、丹參10 g、柴胡10 g、姜黃10 g、郁金10 g、白芥子5 g、九香蟲5 g組成。中藥購自湖南中醫藥大學第一附屬醫院，采用自動煎藥壺煎煮，煎煮方法：一煎加水500 mL，煎汁200 mL，二煎加水300 mL，煎汁150 mL。將兩次煎汁混合，轉移至旋轉蒸發儀中濃縮，濃縮至生藥濃度為1.5 g/mL，待冷卻后置于4 ℃冰箱冷藏備用。將12只雄性SPF級SD大鼠隨機分為兩組，其中空白組4只、中藥組8只。分別對兩組大鼠進行灌胃，灌胃量參照《藥理實驗方法學（第4版）》[10]換算。以60 kg成年人每日劑量70 g原藥材為依據，大鼠劑量按體表面積計算，按人等效面積的2倍劑量給藥。空白組給予等體積蒸餾水，每日灌胃1次，連續1周。末次給藥1 h后腹主動脈采血，室溫靜置1 h后離心（3000 r/min，10 min，離心半徑7 cm）。取上清液，在56 ℃水浴下滅活30 min，過濾、分裝并凍存于-20 ℃冰箱備用。

細胞實驗分組及給藥：取對數生長期的大鼠H9c2心肌細胞，按密度1×105個/孔接種于6孔板，待細胞貼壁生長后，隨機將細胞分為7組：正常組（正常培養）、模型組（OGD/R）、中藥組（OGD/R+含藥血清）、抑制劑組（OGD/R+鐵死亡抑制劑）、激動劑組（OGD/R+鐵死亡激動劑）、聯合組（OGD/R+鐵死亡激動劑+含藥血清）、空白血清組（OGD/R+空白血清）。在復灌時，模型組使用完全培養基;中藥組使用含15%含藥血清的高糖DMEM培養基;抑制劑組使用含鐵死亡抑制劑Ferrostatin-1（Fer-1）（0.5 μmol/L）的完全培養基;激動劑組使用含愛拉斯汀（Erastin）（10 μmol/L）的完全培養基;聯合組使用含Erastin（10 μmol/L）的15%含藥血清培養基;空白組使用含15%空白血清的高糖DMEM培養基。

1.3? 檢測指標

1.3.1? 細胞存活率檢測? 將處于對數生長期的大鼠H9c2心肌細胞制成單細胞懸液，按密度5×103個/孔接種于96孔板內，每孔體積100 μL，每組設3個復孔。96孔板最外面一圈易產生邊緣效應，不接種細胞。待細胞貼壁后按“1.2.1”“1.2.2”項進行造模、分組及給藥。待OGD/R處理完成后，向每孔內加入100 μL的CCK-8反應混合液（1 mL CCK-8溶液+10 mL完全培養基），置于37 ℃、5%CO2培養箱繼續孵育4 h。孵育完成后將96孔板置于酶聯免疫檢測儀中，于450 nm波長下，檢測各孔吸光度（OD）值，計算細胞存活率。

1.3.2? 線粒體膜電位檢測? 將對數生長期的大鼠H9c2心肌細胞按密度1×105個/孔接種于6孔板，待細胞貼壁生長后按“1.2.1”“1.2.2”項進行造模、分組及給藥。按試劑盒說明書配制線粒體膜電位檢測工作液，各組OGD/R處理后，去除培養基，用PBS洗滌1次，然后每孔加入1 mL染色工作液，置于37 ℃、5%CO2細胞培養箱中孵育30 min。待孵育結束后，吸除上清液，用預熱的細胞培養基洗滌2次。最后加入2 mL預熱的細胞培養基，置于激光共聚焦顯微鏡下觀察拍照。

1.3.3? 細胞內鐵離子檢測? 以DMSO溶解FerroOrange，制成1 mmol/L的FerroOrange溶液，用HBSS溶液將FerroOrange溶液稀釋為1 μmol/L的FerroOrange工作液。將大鼠H9c2心肌細胞造模、分組、給藥，OGD/R處理后，去除培養基，用無血清培養基清洗3次。加入1 μmol/L的FerroOrange工作液，在37 ℃、5%CO2培養箱中培養30 min后置于激光共聚焦顯微鏡下觀察拍照。

1.3.4? ROS水平檢測? 用無血清培養基稀釋DCFH-DA，使終濃度為10 μmol/L。細胞經分組處理后，去除培養基，加入1 mL DCFH-DA工作液，置于37 ℃、5%CO2細胞培養箱內孵育20 min。孵育完成后用無血清細胞培養基洗滌細胞3次，以充分去除未進入細胞內的DCFH-DA。最后置于激光共聚焦顯微鏡下觀察拍照。

1.4? 統計學方法

采用統計學軟件SPSS 25.0分析數據。計量資料以“x±s”表示，多組比較，同時滿足正態性及方差齊性者，采用單因素方差分析（one-way ANOVA），若不滿足正態性者采用多個獨立樣本比較的秩和檢驗（Kruskal-Wallis H test），以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1? 不同處理對心肌細胞存活率的影響

與正常組相比，模型組細胞存活率顯著下降（P<0.01），提示造模成功。抑制劑組、中藥組和聯合組細胞存活率較模型組顯著提高（P<0.01）。空白血清組細胞存活率較正常組顯著下降（P<0.01），與模型組比較差異無統計學意義（P>0.05）。詳見表1。

2.2? 不同處理對心肌細胞線粒體膜電位的影響

與正常組相比，模型組及空白血清組線粒體膜電位顯著下降（P<0.01）。空白血清組與模型組線粒體膜電位差異無統計學意義（P>0.05）。與模型組相比，中藥組及抑制劑組線粒體膜電位顯著升高（P<0.01）;激動劑組線粒體膜電位顯著降低（P<0.01）。聯合組線粒體膜電位水平較激動劑組明顯升高（P<0.01）。中藥組和抑制劑組線粒體膜電位差異無統計學意義（P>0.05）。詳見圖1—2。

2.3? 不同處理對心肌細胞Fe2+水平的影響

正常組細胞內Fe2+呈較低水平，模型組和空白血清組Fe2+水平較正常組顯著升高（P<0.01）。空白血清組與模型組Fe2+水平差異無統計學意義（P>0.05）。中藥組及抑制劑組Fe2+較模型組顯著下降（P<0.01）;激動劑組Fe2+較模型組顯著升高（P<0.01）;聯合組Fe2+水平較激動劑組顯著下降（P<0.01）。中藥組和抑制劑組Fe2+水平差異無統計學意義（P>0.05）。詳見圖3—4。

2.4? 不同處理對心肌細胞ROS水平的影響

正常組細胞內ROS呈較低水平，模型組和空白血清組ROS水平較正常組顯著升高（P<0.01）。中藥組及抑制劑組ROS水平較模型組顯著下降（P<0.01），激動劑組ROS水平較模型組顯著升高（P<0.01），聯合劑組ROS水平較激動劑組顯著下降（P<0.01）。中藥組和抑制劑組ROS水平差異無統計學意義（P>0.05）。詳見表2、圖5。

3 討論

急性心肌梗死在臨床上屬于常見的危急重癥，盡早恢復心臟血液供應是有效的治療方法。但血供恢復后，MI/R是造成心肌損傷進一步加重的主要原因。因此，如何減輕MI/R損傷是臨床治療心肌梗死的研究重點。近期研究表明，在MI/R損傷中，存在一種新的細胞死亡方式，稱為鐵死亡[11]。鐵死亡是2012年由Dixon等提出的新型調節性細胞死亡方式，其過程為亞鐵離子蓄積引發芬頓反應，造成細胞抗氧化能力耗竭、脂質過氧化，最終引起細胞死亡[12]。其主要特征是Fe2+水平升高、ROS堆積、GSH合成下降、脂質過氧化產物如MDA等含量增加，導致細胞膜破損，甚至細胞死亡。鐵死亡的提出，為MI/R損傷的治療提供了新的思路[13]。

追溯中醫經典，MI/R損傷屬于中醫“胸痹心痛”范疇，多由寒邪內侵、飲食失調、情志失節、年老體虛等因素引起肝、脾、腎等臟器功能失調所致。其病機多為本虛標實，氣虛、陽虛引起氣機不暢，血行無力，痰瘀互結，心脈痹阻，發為胸痹心痛，所以氣虛痰瘀為其基本病機[14]。從肝治心組方基于“從肝治心、心肝雙治”理論，以補氣養營、疏肝理氣、豁痰化瘀為法，在臨床上具有較好療效[15]。紅參、當歸為方中君藥。紅參具有大補元氣、安神益智、滋養心營之功效。研究表明，紅參多糖能調控Nrf2/HO-1信號通路，抗心肌細胞凋亡，減輕小鼠心肌缺血損傷[16]。當歸能養血補血活血，為“血藥之主帥”。壽曄等[17]研究發現，當歸揮發油能夠抑制氧化應激和炎癥反應，起到對MI/R損傷的保護作用。丹參、柴胡、郁金、姜黃共為方中臣藥。丹參味苦微寒，專調經脈，能生新血、去惡血，起入心養血、調血通脈之功。柴胡辛行苦泄，性善調達，具有疏肝散郁之功;郁金辛散苦泄，能清心散郁、活血祛瘀。姜黃“苦能泄熱，辛能散結，為破血下氣，血分氣分之要藥”，能理氣中之血又能行血中之氣。四藥合用，使肝氣通，心氣和。白芥子為方中佐藥，其性味辛溫，為利氣疏痰、溫中去滯之要藥。九香蟲為方中使藥，性味咸溫，有宣胸膈、理氣滯之功，使氣血雙宣、絡通痛止。諸藥配伍，共奏益氣營、疏肝氣、化痰瘀、通心絡之效。課題組前期實驗研究表明，從肝治心組方對缺血心肌有保護作用，但其對心肌細胞鐵代謝是否具有調節作用尚不清楚[18]。因此，本研究以大鼠H9c2心肌細胞為研究對象進行體外實驗，觀察從肝治心組方對心肌細胞鐵代謝的作用。

本研究選用Erastin作為鐵死亡激動劑，Fer-1作為鐵死亡抑制劑。有研究表明，還原型谷胱甘肽（glutathione， GSH）可以防止脂質過氧化，抑制鐵死亡的發生[19]。GSH的合成需要胱氨酸，而胱氨酸進入細胞內的過程依賴于胱氨酸/谷氨酸逆向轉運體（System Xc-）。System Xc-由糖基化的重鏈SLC3A2和非糖基化的輕鏈xCT（SLC7A11）組成，是胱氨酸和谷氨酸交換的主要途徑[20]。因此，阻斷System Xc-可使GSH合成受阻，細胞抗氧化能力下降，最終導致鐵死亡的發生[21-23]。Erastin是一種高效的鐵死亡誘導劑，其作用機制為抑制System Xc-，從而誘導鐵死亡的發生[24]。Erastin可誘導包括心肌細胞[25]、神經元細胞[26]、癌癥細胞[27]等在內的多種離體細胞鐵死亡的發生，表現為細胞內Fe2+濃度升高，ROS生成增多、脂質過氧化物含量增加等。Fer-1是人為合成的芳烷基胺，為一種特異性鐵死亡抑制劑，主要通過還原反應發揮抗氧化作用，減少ROS蓄積，抑制鐵死亡的發生[28]。

本實驗通過OGD/R模型模擬心肌細胞MI/R損傷，用CCK-8法檢測細胞存活率。模型組細胞存活率較正常組顯著下降，表明OGD/R可使大鼠H9c2心肌細胞明顯死亡，提示造模成功。CCK-8實驗結果提示，抑制劑組細胞存活率較模型組顯著提高，提示心肌細胞OGD/R處理后可能存在鐵死亡。而Fer-1通過抑制鐵死亡途徑，降低心肌細胞的死亡率，起到保護心肌的作用。為進一步研究MI/R損傷后心肌細胞鐵代謝以及從肝治心組方干預對鐵代謝的調節作用，選用TMRE熒光探針檢測線粒體膜電位，FerroOrange檢測細胞內Fe2+水平，DCFH-DA熒光探針檢測各組細胞ROS水平。與模型組比較，抑制劑組線粒體膜電位顯著升高，Fe2+水平顯著降低，ROS水平顯著下降。提示Fer-1能抑制OGD/R后心肌細胞鐵死亡，起到減輕心肌細胞損傷的作用，進一步驗證了心肌細胞OGD/R后存在鐵死亡。與模型組相比，中藥組線粒體膜電位顯著升高，Fe2+水平顯著降低，ROS水平顯著下降。提示從肝治心組方可能通過減少細胞內Fe2+堆積或減少Fe2+形成、降低細胞內ROS水平、改善線粒體活性等抑制鐵死亡，發揮對OGD/R處理后心肌細胞的保護作用。激動劑組與模型組相比，線粒體膜電位顯著降低，Fe2+水平顯著升高，ROS水平顯著升高，提示Erastin可能通過抑制System Xc-，促進心肌細胞鐵死亡。聯合組與激動劑組相比，線粒體膜電位顯著升高，Fe2+水平顯著下降，ROS水平顯著下降，提示從肝治心組方可能通過激活System Xc-發揮對鐵死亡的抑制作用。

綜上所述，本實驗初步研究發現MI/R損傷后心肌細胞存在鐵死亡，從肝治心組方可以改善線粒體活性，降低細胞內Fe2+和ROS水平，從而抑制鐵死亡途徑，減少心肌細胞損傷。但具體機制仍需進一步研究。

參考文獻

[1] 中國心血管健康與疾病報告編寫組. 中國心血管健康與疾病報告2021概要[J]. 心腦血管病防治， 2022， 22（4）： 20-36， 40.

[2] GUNATA M， PARLAKPINAR H. A review of myocardial ischaemia/reperfusion injury： Pathophysiology， experimental models， biomarkers， genetics and pharmacological treatment[J]. Cell Biochemistry and Function， 2021， 39（2）： 190-217.

[3] WU X G， LI Y， ZHANG S C， et al. Ferroptosis as a novel therapeutic target for cardiovascular disease[J]. Theranostics， 2021， 11（7）： 3052-3059.

[4] PAN Y H， WANG X K， LIU X W， et al. Targeting ferroptosis as a promising therapeutic strategy for ischemia-reperfusion injury[J]. Antioxidants， 2022， 11（11）： 2196.

[5] CHEN X， COMISH P B， TANG D L， et al. Characteristics and biomarkers of ferroptosis[J]. Frontiers in Cell and Developmental Biology， 2021， 9： 637162.

[6] 李金洋， 范金茹， 葉銘泉， 等. 名老中醫王行寬肝心同治心系病遣方經驗探討[J]. 湖南中醫藥大學學報， 2014， 34（6）： 19-22.

[7] 劉小雨， 王行寬， 楊孝芳. 從肝治心組方對實驗性心肌梗死大鼠心肌血管新生的影響[J]. 中國中醫急癥， 2004， 13（6）： 379-380， 338.

[8] 劉小雨， 王行寬， 楊孝芳. 從肝治心組方對急性心肌梗死大鼠心肌毛細血管密度的影響[J]. 中國中西醫結合急救雜志， 2004， 11（1）： 17-20.

[9] WANG S， GE L， ZHANG D W， et al. MiR-181c-5p promotes inflammatory response during hypoxia/reoxygenation injury by downregulating protein tyrosine phosphatase nonreceptor type 4 in H9C2 cardiomyocytes[J]. Oxidative Medicine and Cellular Longevity， 2020， 2020： 7913418.

[10] 魏偉， 吳希美， 李元建. 藥理實驗方法學[M]. 4版. 北京： 人民衛生出版社， 2010.

[11] 方? 瑾， 黃? 鶴. 鐵代謝在心肌缺血再灌注損傷及心臟保護中的作用及機制[J]. 醫學綜述， 2022， 28（6）： 1046-1050.

[12] DIXON S J， LEMBERG K M， LAMPRECHT M R， et al. Ferroptosis： An iron-dependent form of nonapoptotic cell death[J]. Cell， 2012， 149（5）： 1060-1072.

[13] ZHAO W K， ZHOU Y， XU T T， et al. Ferroptosis： Opportunities and challenges in myocardial ischemia-reperfusion injury[J]. Oxidative Medicine and Cellular Longevity， 2021， 2021： 9929687.

[14] 王子焱， 歐陽青蘭， 譚? 超. 基于數據挖掘的國醫大師熊繼柏治療胸痹心痛方藥規律研究[J]. 湖南中醫藥大學學報， 2023， 43（2）： 189-196.

[15] 伍? 瑤， 范金茹， 王行寬， 等. 全國名中醫王行寬肝心同治胸痹心痛的驗方及經驗傳承[J]. 中醫藥臨床雜志， 2019， 31（9）： 1631-1634.

[16] LIAN Y P， ZHU M M， YANG B， et al. Characterization of a novel polysaccharide from red ginseng and its ameliorative effect on oxidative stress injury in myocardial ischemia[J]. Chinese Medicine， 2022， 17（1）： 111.

[17] 壽? 曄， 秦宇芬. 當歸揮發油對缺血再灌注致心肌損傷大鼠的心肌保護作用[J]. 浙江中醫雜志， 2022， 57（2）： 99-100.

[18] 胡國恒， 陳? 亞， 張? 婷， 等. 從肝治心組方對大鼠缺血心肌血管新生因子Ang-1/Ang-2表達的影響[J]. 中國中醫急癥， 2013， 22（11）： 1830-1833.

[19] URSINI F， MAIORINO M. Lipid peroxidation and ferroptosis： The role of GSH and GPx4[J]. Free Radical Biology & Medicine， 2020， 152： 175-185.

[20] LI F J， LONG H Z， ZHOU Z W， et al. System Xc-/GSH/GPX4 axis： An important antioxidant system for the ferroptosis in drug-resistant solid tumor therapy[J]. Frontiers in Pharmacology， 2022， 13： 910292.

[21] CHEN L， QIAO L L， BIAN Y， et al. GDF15 knockdown promotes erastin-induced ferroptosis by decreasing SLC7A11 expression[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications， 2020， 526（2）： 293-299.

[22] WANG L Y， LIU Y C， DU T T， et al. ATF3 promotes erastin-induced ferroptosis by suppressing system Xc[J]. Cell Death and Differentiation， 2020， 27（2）： 662-675.

[23] PARKER J L， DEME J C， KOLOKOURIS D， et al. Molecular basis for redox control by the human cystine/glutamate antiporter system Xc[J]. Nature Communications， 2021， 12（1）： 7147.

[24] DIXON S J， PATEL D N， WELSCH M， et al. Pharmacological inhibition of cystine-glutamate exchange induces endoplasmic reticulum stress and ferroptosis[J]. eLife， 2014， 3： e02523.

[25] 趙述傲， 朱儀章， 濮雨凌， 等. 鐵死亡在大鼠心肌缺血-再灌注損傷中的作用[J]. 中國急救醫學， 2022， 42（1）： 53-57.

[26] WEI N， LU T， YANG L B， et al. Lipoxin A4 protects primary spinal cord neurons from Erastin-induced ferroptosis by activating the Akt/Nrf2/HO-1 signaling pathway[J]. FEBS Open Bio， 2021， 11（8）： 2118-2126.

[27] ZHANG Y， TAN H， DANIELS J D， et al. Imidazole ketone erastin induces ferroptosis and slows tumor growth in a mouse lymphoma model[J]. Cell Chemical Biology， 2019， 26（5）： 623-633.

[28] MIOTTO G， ROSSETTO M， DI PAOLO M L， et al. Insight into the mechanism of ferroptosis inhibition by ferrostatin-1[J]. Redox Biology， 2020， 28： 101328.