UPLC-MS/MS法測定大鼠血漿中婦科斷紅飲膠囊3種有效成分的含量及其藥代動力學研究

牟晴蕊 白璐 趙洪慶 譚喜平 王宇紅 吳夢瑤

〔摘要〕 目的 建立UPLC-MS/MS法測定大鼠血漿中婦科斷紅飲膠囊主要有效成分在大鼠血漿中的濃度，并初步研究其在大鼠體內的藥代動力學行為。方法 雌性SD大鼠單次或重復灌胃給藥婦科斷紅飲膠囊內容物后，收集72 h內的血液樣本，通過UPLC-MS/MS同時測定3種指標性成分的濃度，由Phoenix WinNonlin 8.1計算藥代動力學參數。結果 以苯海拉明為內標，芍藥苷、益母草堿、三七皂苷R1的檢測范圍分別為2～2000、0.1～300、0.1～800 ng·mL-1。準確度分別在85%～115%之間，日內精密度與日間精密度RSD≤15%。與單次給藥組比較，重復給藥組大鼠3種成分的藥時曲線下面積顯著增大，平均滯留時間MRT（0-∞）顯著延長（P<0.01），消除半衰期t1/2無明顯變化。結論 該方法線性關系良好，線性范圍寬，定量限低，精密度、回收率等均符合生物樣品定量要求，提示該方法快速、靈敏、重復性好，可用于婦科斷紅飲膠囊3種有效成分在大鼠體內的相關藥代動力學研究。以其主要成分芍藥苷、益母草堿和三七皂苷R1為代表，婦科斷紅飲膠囊具有吸收快、分布廣的優點。

〔關鍵詞〕 婦科斷紅飲;芍藥苷;益母草堿;三七皂苷R1;藥時曲線;藥代動力學;UPLC-MS/MS

〔中圖分類號〕R284? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2023.06.011

〔Abstract〕 Objective To establish an UPLC-MS/MS method to determine the concentration of the main active ingredients of Fuke Duanhongyin Capsule （FKDHYC） in rat plasma and to preliminarily study their pharmacokinetic behaviors in rats. Methods After single or repeated gavage administration of FKDHYC in female Sprague-Dawley （SD） rats， blood samples were collected within 72 h. The concentration of the three indicator ingredients were determined simultaneously by UPLC-MS/MS and pharmacokinetic parameters calculated by Phoenix WinNonlin 8.1. Results With diphenhydramine hydrochloride as the internal standard， the detection ranges of paeoniflorin， leonurine and notoginsenoside R1 were 2～2000， 0.1～300， 0.1～800 ng·mL-1 respectively. The accuracy was in the range of 85%～115%， and the intra-day and inter-day precisions were≤15%. Compared with the single administration group， the area under the concentration-time curve of the three ingredients in the repeated administration group was significantly increased and the mean retention time （MRT（0-∞）） was significantly extended （P<0.01）， while the elimination half-life （t1/2） showed no significant change. Conclusion The method of UPLC-MS/MS has good linearity， wide linear range， and low limit of quantification. The precision and recovery meet the requirements for the quantification of biological samples， suggesting that the method is rapid， sensitive and reproducible， and can be used for the pharmacokinetic study of the three active ingredients of FKDHYC in rats. Represented by paeoniflorin， leonurine， and notoginsenoside R1， FKDHYC has the advantages of fast absorption and wide distribution.

〔Keywords〕 Fuke Duanhongyin; paeoniflorin; leonurine; notoginsenoside R1; concentration-time curve; pharmacokinetics; UPLC-MS/MS

婦科斷紅飲膠囊由赤芍、益母草、三七、仙鶴草、地榆炭、蒲黃炭6味藥材組成，有涼血、止血、化瘀的功效，可用于子宮功能性出血（dysfunctional uterine bleeding， DUB）的治療。臨床試驗結果表明，婦科斷紅飲膠囊治療DUB療效顯著，試驗過程中沒有明顯不良反應，提示該藥安全有效[1-3]。目前，該制劑藥效良好，組方藥物中益母草辛散苦泄，尤善治瘀血經產諸病，為婦科調經良藥;赤芍苦能泄散，既清肝火涼血，又活血化瘀;三七微苦泄散，止血與化瘀力均強，有止血而不留瘀、活血而不耗氣之優;仙鶴草苦澀收斂，止血力強，凡出血無論寒、熱、虛、實皆宜;地榆炭味苦降泄，有涼血止血、消腫止痛之功效，善治下焦血熱妄行諸證;蒲黃炭性平不偏，生行炒斂，炒炭后長于收澀，略兼化瘀，為化瘀止血之要藥[4-8]。但由于復方成分的復雜性和多樣性，該制劑的體內過程尚未明晰。

網絡藥理學分析結果顯示，婦科斷紅飲膠囊可能通過多種活性成分發揮止血化瘀作用。體內實驗結果顯示，婦科斷紅飲膠囊亦可改善出血癥狀，調節多種蛋白表達[9-10]。前期文獻調研發現，婦科斷紅飲膠囊治療DUB的3個潛在活性成分，分別為赤芍中的芍藥苷[11-12]、益母草中的益母草堿[13-16]與三七中的三七皂苷R1[17]。實驗建立了同時測定婦科斷紅飲膠囊中3種有效成分的UPLC-MS/MS定量方法，用于該制劑的藥代動力學研究。

1 材料

1.1? 主要儀器與試劑

Waters ACQUITY型超高效液相色譜儀（美國Waters公司）;AB Sciex QTRAP 5500型三重四極桿質譜儀（美國AB SCIEX公司）;Labconco CentriVap型冷凍臺式真空離心濃縮儀（美國Labconco公司）;SorvaLL ST8R型高速離心機（美國Thermo Fisher Scientific公司）;Option R7 utra AN型超純水系統（英國ELGA LabWaters公司）;XS205DU型十萬分之一分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）;LC-DCY-24GP型48孔干式氮吹儀（力辰科技有限公司）;KQ-800DE型中文液晶臺式超聲波清洗器（昆山美美超聲儀器有限公司）。甲醇（質譜純，德國Merck KGaA公司，批號：204681）、乙腈（質譜純，德國Merck KGaA公司，批號：204681）;甲酸（質譜純，德國CNW公司，批號：84890090）。

1.2? 試藥

供試品：婦科斷紅飲膠囊由株洲千金藥業股份有限公司生產，國藥準字：Z20090713，批號：20200702，規格：0.4 g×18粒。

對照品：芍藥苷（批號：1110736-202044;純度>96.8%）、鹽酸益母草堿（批號：111823-201704;純度>94.3%）、三七皂苷R1（批號：110745-201921;純度>90.4%）均購自中國食品藥品檢定研究院。

1.3? 動物

健康雌性SD大鼠，SPF級，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司（質量合格證編號：4307272011016

98124），體質量（190±10） g;飼養于湖南中醫藥大學實驗動物中心[許可證號：SCXK（湘）2019-0004]。本實驗經湖南中醫藥大學實驗動物倫理委員會審查通過（倫理審查號：LLBH-202012070002）。

2 方法與結果

2.1? 色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC[○][R]HSS T3（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）。流動相：0.1%甲酸水（A）-甲醇（B），梯度洗脫，0～2 min，95%～5% A;2～3 min，5% A;3～3.1 min，5%～95% A;3.1～5 min，95% A。體積流量0.3 mL/min。柱溫：40 ℃。樣品溫度：4 ℃。進樣量：5 μL。

2.2? 質譜條件

質譜條件：噴霧離子源;正、負離子模式同時掃描;多重反應監測模式;源噴射電壓：5500、-4500 V;源溫度：550 ℃;霧化氣壓力：50 psi（1 psi≈6.895 kPa）;氣簾氣壓力：50 psi（1 psi≈6.895 kPa）;碰撞反應氣：氮氣。芍藥苷、益母草堿、三七皂苷R1以及內標物苯海拉明的質譜參數見表1。

2.3? 標準曲線樣品與質控樣品配制

對照品溶液配制：精密稱取芍藥苷、益母草堿、三七皂苷R1各對照品適量，加50%甲醇定容到5 mL容量瓶中，制成濃度分別為1.08、1.10、1.02 mg·mL-1的對照品儲備液。臨用前，吸取一定量儲備液，置于容量瓶中，甲醇稀釋定容，用50%甲醇按梯度稀釋到所需要的濃度，即得混合系列對照品溶液，備用。

內標溶液的配制：精密稱取苯海拉明標準品適量，置于10 mL容量瓶中，得到1 mg·mL-1的苯海拉明標準品溶液，加50%甲醇逐漸稀釋成5 ng·mL-1的苯海拉明標準品溶液。

2.4? 血漿樣品處理[18]

取100 μL血漿，加入3倍量冰甲醇，渦旋2 min混勻后冰浴10 min。設置離心機溫度為4 ℃，以12 000 r·min-1離心5 min（離心半徑6 cm），取上清液置1.5 mL EP管中，用氮吹儀揮干溶劑，用50%甲醇（提前冰浴）復溶，在4 ℃下以12 000 r·min-1離心5 min（離心半徑6 cm），取上清液置于具內置插管的進樣瓶中。

2.5? 方法學考察[19-22]

2.5.1? 專屬性? 取濃度為25 ng·mL-1的混標溶液與內標溶液進行混合，加入到大鼠空白血漿中，另取內標溶液加入含藥血漿中，再取空白血漿，將上述3個樣品分別按“2.4”項下條件處理，檢測。3種有效成分及內標物在掃描模式下得到的質譜色譜圖專屬性良好，待測物質在特定保留時間下無雜質及代謝產物響應干擾。詳見圖1。

2.5.2? 線性、檢測限與定量限? 分別取不同濃度系列混標溶液各100 μL，等體積1∶1與空白血漿混合后按“2.4”項下條件處理。LC-MS/MS測定，記錄峰面積，分別以血漿中各成分的濃度值為橫坐標，以各成分和內標苯海拉明的峰面積比值為縱坐標作圖，采用1/x2權重后得到各成分標準曲線。以標準曲線最低濃度做定量限，另取定量限濃度樣品，平行樣品5個，操作同上，分別計算濃度，并得到平行樣品濃度之間的RSD。對血漿中各成分的線性關系和定量限進行考察。結果顯示，3個待測成分線性良好，范圍較寬，均符合生物樣品線性檢測要求。同時，該方法檢測限低，響應好。定量限較低且均≥70 S/N，平行樣品濃度之間的RSD≤20%，符合《藥物非臨床藥代動力學研究技術指導原則》[22]要求。詳見表2。

2.5.3? 準確度與精密度? 取配制好的低、中、高質量濃度的質控樣品，按“2.4”項下條件處理，各平行5份，代入線性方程，計算測定值Cr，與加入的標示量Cz比較，Cr/Cz得準確度。同一日內，不同濃度的同一血漿樣品平行進樣5次，隨行標曲計算日內精密度;每日每個濃度制備一個，連續5批，每日繪制隨行標曲，計算實測濃度，計算日間精密度。結果顯示，日內與日間精密度均≤15%，準確度為85%～115%，符合生物樣品要求。詳見表3。

2.5.4? 穩定性? 按照“2.4”項下條件，配制低、中、高質量濃度的質控樣品，每個濃度各3組，每組5份。第1組樣品室溫放置24 h，第2組于4 ℃放置5 d，第3組樣品于-80 ℃反復凍融3次，記錄峰面積，計算穩定性。結果顯示，3種成分的日內穩定性、日間穩定性、血漿凍融穩定性均為80%～120%，詳見表4。表明樣品在3種不同條件下處理后，均對待測樣品的測定無顯著性影響。

2.5.5? 基質效應與提取回收率? 分別取平行5份配制低、中、高質量濃度的質控樣品，按“2.4”項下條件處理，測定峰面積值Ar。另取低、中、高3個濃度的混標溶液與內標溶液混合，測定峰面積值Az。再取平行5份空白血漿按“2.4”項下條件處理后加入低、中、高濃度去除溶劑的混標溶液和內標溶液，制備得標準對照樣品，測定峰面積值As。As/Az得基質效應，Ar/As得提取回收率。結果表明，芍藥苷在低、中、高3個質量濃度中的基質效應為90.46%～100.10%，提取回收率為109.60%～114.10%，益母草堿在低、中、高3個質量濃度中的基質效應為89.90%～93.63%，提取回收率為88.00%～94.90%。提示基質效應很小，提取回收率較高，符合對生物樣品的測定要求。三七皂苷R1提取回收率較低，且有較為明顯的基質增強作用，查閱文獻得知為三七皂苷R1入血后的普遍現象[19]，3種成分在不同質量濃度樣品的基質效應、回收率測定值趨于穩定。

2.6? 婦科斷紅飲膠囊藥代動力學研究

雌性SD大鼠15只，飼養于標準鼠籠中，保持室溫（22±2） ℃，相對濕度為40%～70%，于實驗前12 h禁食，動物在實驗期間自由飲水，并于給藥后2 h自由進食標準鼠糧。大鼠隨機分成3組：單次給藥組（1.944 g/kg灌胃給藥1 d受試藥物，1次，6只）、重復給藥組（1.944 g/kg連續灌胃給藥5 d受試藥物，每日1次，6只）、空白組（3只）。分別于給藥后0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、4、8、12、24、48、72 h頸靜脈采血約0.3 mL，加入0.5%肝素鈉潤洗干燥后的離心管中，設置離心機溫度為4 ℃，以4500 r·min-1離心5 min（離心半徑6 cm）后，取上層血漿，儲存于-80 ℃冰箱備用。按“2.4”項下方法進行血漿樣品預處理，再按“2.1”和“2.2”項下條件進樣測定。采用UPLC-MS/MS法進行藥物濃度分析測定，并用Phoenix WinNonlin 8.1藥代動力學軟件處理數據。根據血藥濃度與時間的關系，以時間為橫坐標，血藥濃度為縱坐標繪制藥時曲線。對藥時曲線進行擬合，采用非房室摸型計算各成分藥代動力學參數。

2.6.1? 芍藥苷藥時曲線及藥代動力學參數? 灌胃給藥婦科斷紅飲膠囊內容物，經計算后得到芍藥苷的給藥劑量為85 145 782.066 ng/kg，藥時曲線見圖2，藥代動力學參數見表5。

2.6.2? 益母草堿藥時曲線及藥代動力學參數? 灌胃給藥婦科斷紅飲膠囊內容物，經計算后得到益母草堿的給藥劑量為11 326 994.772 ng/kg，藥時曲線見圖3，藥代動力學參數見表6。

2.6.3? 三七皂苷R1藥時曲線及藥代動力學參數? 灌胃給藥婦科斷紅飲膠囊內容物，經計算后得到三七皂苷R1的給藥劑量為386.618 ng/kg，藥時曲線見圖4，藥代動力學參數見表7。

3 討論

在探索預處理方法的過程中發現芍藥苷在血漿中存在室溫下降解的問題，通過查閱文獻得知芍藥苷的降解速率隨溫度的降低而降低，在4 ℃時基本穩定[23]，故血漿樣品處理過程均嚴格控制在4 ℃下進行。本實驗采用蛋白沉淀法處理血漿樣本，在前期實驗中分別用甲醇、乙腈兩種溶劑作為沉淀溶劑，通過計算回收率發現，使用甲醇沉淀更適用于婦科斷紅飲膠囊中3種有效成分。

本研究首次建立了同時測定婦科斷紅飲膠囊中多種有效成分在大鼠血漿中的定量分析方法，該方法線性關系良好，線性范圍寬，定量限低，方法穩定、靈敏，精密度、回收率等均符合生物樣品定量要求。藥代動力學結果顯示，重復給藥后芍藥苷的Cmax/AUC明顯升高，表明與單次給藥相比芍藥苷在體內的吸收程度顯著下降，吸收速度加快。三七皂苷R1的CL下降、AUC（0-t）和AUC（0-∞）降低、MRT（0-t）顯著提高，表明與單次給藥相比，重復給藥后三七皂苷R1在體內滯留時間延長，推測其生物利用度有明顯提高。益母草堿的CL升高而其余參數無明顯差異。結合藥時曲線結果可知，大鼠單次給藥后，三七皂苷R1吸收快、消除快;益母草堿、芍藥苷吸收快，消除較慢。多次給藥后，大鼠體內沒有芍藥苷和益母草堿蓄積，有少量三七皂苷R1積蓄。與單次給藥相比，多次給藥后主要藥代動力學參數發生顯著改變，其科學內涵仍待藥理學實驗驗證。

中藥復方所含化學成分復雜，藥理作用具有多靶點、多途徑、多環節的特點，致使中藥復方研究往往遇到物質基礎不清、作用機制不明、研究基礎與臨床應用脫節等問題[24]。而中藥復方藥代動力學就是連接中醫藥理論與臨床應用的橋梁，是闡釋中藥如何發揮藥效的數據支撐[25]。本文以婦科斷紅飲膠囊為載體，考察其主要活性成分在大鼠體內的時量關系，明確其體內處置過程，為后續婦科斷紅飲膠囊臨床研究奠定基礎，并為中藥創制提供新思路。

參考文獻

[1] 謝智菲. 婦科斷紅飲膠囊治療血熱內擾型功能失調性子宮出血臨床觀察[J]. 中國中醫藥現代遠程教育， 2022， 20（21）： 45-47.

[2] 錢雅麗， 張永存， 史慧星， 等. 婦科斷紅飲膠囊聯合左炔諾孕酮治療功能失調性子宮出血的臨床研究[J]. 現代藥物與臨床， 2023， 38（3）： 671-675.

[3] 劉建武， 陶莉莉， 邱如卿， 等. 婦科斷紅飲膠囊治療血熱內擾證功能失調性子宮出血324例臨床研究[J]. 中醫藥臨床雜志， 2011， 23（7）： 628-630.

[4] 陳文鵬， 盧健棋， 龐? 延， 等. 仙鶴草化學成分、藥理作用及臨床應用研究進展[J]. 遼寧中醫藥大學學報， 2022， 24（6）： 118-122.

[5] 高明亮， 藍錦珊， 單鳴秋， 等. 中藥炭藥研究進展與研究策略思考[J]. 南京中醫藥大學學報， 2020， 36（5）： 696-703.

[6] 楊映映， 唐浚峰， 李青偉， 等. 炭類中藥藥理研究及臨床應用[J]. 遼寧中醫藥大學學報， 2020， 22（10）： 186-190.

[7] 張向陽， 劉春燕， 賈麗霞， 等. 炒地榆炭及烘地榆炭對小鼠出血、凝血時間的影響[J]. 河南中醫， 2017， 37（12）： 2109-2110.

[8] 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典2020年版一部[M]. 北京： 中國醫藥科技出版社， 2020： 144-145.

[9] 何? 瓔， 趙洪慶， 吳夢瑤， 等. 基于網絡藥理學及實驗驗證探究婦科斷紅飲膠囊治療功能失調性子宮出血的作用機制[J]. 世界科學技術（中醫藥現代化）， 2022， 24（11）： 4444-4454.

[10] 何? 瓔， 凌勇根， 趙洪慶， 等. 婦科斷紅飲膠囊改善大鼠功能失調性子宮出血的作用機制研究[J]. 中國藥房， 2022， 33（23）： 2840-2844.

[11] 高? 尚， 陳? 秧， 彭彩云， 等. 止血調經顆粒HPLC指紋圖譜研究及其主成分定量測定[J]. 中草藥， 2019， 50（15）： 3642-3647.

[12] FANG Y S， WU L C， MA K L， et al. Paeoniflorin alleviates lipopo?

lysaccharide-induced disseminated intravascular coagulation by inhibiting inflammation and coagulation activation[J]. Drug Development Research， 2020， 81（4）： 517-525.

[13] 代良萍. 益母草注射液縮宮止血的藥效物質基礎研究[D]. 成都： 成都中醫藥大學， 2017.

[14] 景茹草， 姜向陽. 益宮顆粒促進產后子宮復舊臨床觀察分析[J]. 中國醫藥指南， 2010， 8（1）： 103-104.

[15] 樓彩霞， 龐宗然， 崔? 箭. 婦科出血病證的中藥復方治療[J]. 光明中醫， 2009， 24（10）： 2035-2037.

[16] 李? 霞. 益母草堿對藥物致早孕大鼠不完全流產的影響及其部分機制的研究[D]. 合肥： 安徽醫科大學， 2009.

[17] 譚? 亮， 湯秋凱， 王守章， 等. 三七皂苷R1藥理作用的研究進展[J]. 中國藥理學通報， 2018， 34（5）： 604-607.

[18] 林美妤， 曾? 琪， 陳光宇， 等. UPLC-Q-TOF-MS技術分析黑參在大鼠血清、尿液及糞便中的化學成分[J]. 中藥新藥與臨床藥理， 2022， 33（10）： 1394-1399.

[19] 王? 源. 復方血栓通膠囊主要有效成分的藥代動力學研究[D]. 北京： 北京中醫藥大學， 2014.

[20] 李壯壯. 柴胡桂枝顆粒制劑工藝、質量標準及藥物代謝動力學研究[D]. 濟南： 山東中醫藥大學， 2019.

[21] 朱? 清. 益母草堿在大鼠體內藥動學及代謝研究[D]. 上海： 復旦大學， 2012.

[22] CDE. 藥物非臨床藥代動力學研究技術指導原則[EB/OL]. （2014-05-13） [2023-02-16]. http：//www.cde.org. cn/attachmentout.do？mothed=list&id=5264.

[23] 霍曉光， 胡欣彤， 陳麗霞， 等. 芍藥苷穩定性研究[J]. 中國科技論文， 2017， 12（18）： 2092-2097.

[24] 袁? 瑾， 鈕英杰， 王? 瑩， 等. 中藥復方藥動藥效相關性研究的方法與思考[J]. 湖北中醫藥大學學報， 2011， 13（4）： 60-62.

[25] 蘇如玉， 張? 磊， 張? 玉， 等. 從藥物代謝動力學角度探討中藥復方有效性的思路與方法[J]. 中國中西醫結合雜志， 2016， 36（1）： 111-115.