基于Wnt/β-catenin通路探討隔藥餅灸對高脂血癥兔調脂機制的影響

劉惠娟 歐陽里知 李芊 彭涵 劉紅華 葛君蕓 羅堅 常小榮 劉邁蘭 汪厚蓮

〔摘要〕 目的 觀察隔藥餅灸對高脂血癥兔肝組織Wnt1、β-卷曲蛋白（β-catenin）、散亂蛋白-1（dishevelled-1，dvl-1） 、固醇調節元件結合蛋白1c（sterol regulatory element-binding protein1c， SREBP1c）的mRNA表達量的影響，探討隔藥餅灸調脂的作用機制。方法 將48只新西蘭兔隨機分為正常組、模型組、隔藥餅灸組和阿托伐他汀組，每組12只。正常組采用普通飼料喂養，其余各組采用高脂飼養法喂養8周，待造模成功后，除正常組、模型組外，隔藥餅灸組選取兩組穴位交替施灸（Ⅰ組穴位為巨闕、天樞、豐隆;Ⅱ組穴位為心俞、肝俞、脾俞），阿托伐他汀組將阿托伐他汀鈣片碾成粉末后拌入第一口飼料喂食，每日1次，連續8周。測定各組兔血清總膽固醇（total cholesterol， TC）、甘油三酯（glycerin trilaurate， TG）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol， LDL-C）含量，RT-PCR法測定各組兔Wnt1、β-catenin、dvl-1、SREBP1c的mRNA表達量，油紅O染色觀察肝組織脂質沉積情況。結果 （1）血脂結果：與正常組相比，模型組血清TC、TG、LDL-C上升（P<0.001）;與模型組相比，隔藥餅灸組和阿托伐他汀組TC、TG、LDL-C下降（P<0.01，P<0.001）;隔藥餅灸組與阿托伐他汀組相比，TC、TG、LDL-C差異無統計學意義（P>0.05）。（2）RT-PCR結果：與正常組相比，模型組肝組織Wnt1、β-catenin、dvl-1、SREBP1c的mRNA表達量上升（P<0.001）;與模型組相比，隔藥餅灸組和阿托伐他汀組肝組織Wnt1、β-catenin、dvl-1、SREBP1c的mRNA表達量均下降（P<0.01，P<0.001）;隔藥餅灸組與阿托伐他汀組肝組織Wnt1、β-catenin、dvl-1、SREBP1c的mRNA表達差異無統計學意義（P>0.05）。（3）脂質沉積結果：與正常組相比，模型組、隔藥餅灸組、阿托伐他汀組脂質沉積均有增加，模型組增加更明顯;與模型組相比，隔藥餅灸組、阿托伐他汀組脂質沉積明顯減少;隔藥餅灸組與阿托伐他汀組無明顯差異。結論 隔藥餅灸可能通過抑制Wnt/β-catenin通路，下調高脂血癥兔SREBP1c含量，發揮調脂作用。

〔關鍵詞〕 隔藥餅灸;高脂血癥;血脂;Wnt1;β-卷曲蛋白;散亂蛋白-1;固醇調節元件結合蛋白1c

〔中圖分類號〕R245? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2023.06.022

〔Abstract〕 Objective To observe the effects of medicinal cake-separated moxibustion on Wnt1， β-catenin， dishevelled-1 （dvl-1）， and sterol regulatory element-binding protein1c （SREBP1c） in liver tissue of hyperlipidemia rabbits and to explore the mechanism of action of? medicinal cake-separated moxibustion on lipid regulating. Methods A total of 48 New Zealand rabbits were randomly divided into normal group， model group， medicinal cake-separated moxibustion group， and atorvastatin group， with 12 rabbits in each group. The normal group was fed with normal diet， while the other groups were fed with high-fat diet for 8 weeks. After successful modeling， except normal group and model group， two groups of acupoints in medicinal cake-separated moxibustion group were selected for alternating moxibustion [group Ⅰ： 'Juque' （RN14）， 'Tianshu' （ST25）， and 'Fenglong' （ST40）; group Ⅱ： ‘Xinshu' （BL15）， 'Ganshu' （BL18）， and 'Pishu' （BL20）]; in atorvastatin group， atorvastatin calcium tablets were ground into powder and mixed into the first feed， once a day for 8 consecutive weeks in both groups. The content of total cholesterol （TC）， glycerin trilaurate （TG）， and low density lipoprotein cholesterol （LDL-C） in serum of rabbits in each group were determined. The mRNA expression levels of Wnt1， β-catenin， dvl-1 and SREBP1c were determined by RT-PCR. Lipid deposition in liver tissue was observed by oil red "O" staining. Results （1） Lipid results： Compared with normal group， serum TC， TG， and LDL-C in model group increased （P<0.001）; compared with model group， TC， TG， and LDL-C in medicinal cake-separated moxibustion group and atorvastatin group decreased （P<0.01， P<0.001）; compared with atorvastatin group， there was no significant statistical difference in TC， TG， and LDL-C in medicinal cake-separated moxibustion group （P>0.05）. （2） RT-PCR results： Compared with normal group， mRNA expression levels of Wnt1， β-catenin， dvl-1， and SREBP1c in liver tissue in model group increased （P<0.001）; compared with model group， mRNA expression levels of Wnt1， β-catenin， dvl-1， and SREBP1c in liver tissue in both medicinal cake-separated moxibustion group and atorvastatin group decreased （P<0.01，P<0.001）. There was no significant statistical difference in mRNA expression levels of Wnt1， β-catenin， dvl-1， and SREBP1c in liver tissue between medicinal cake-separated moxibustion group and atorvastatin group （P>0.05）. （3） Lipid deposition results： Compared with normal group， lipid deposition in model group， medicinal cake-separated moxibustion group， and atorvastatin group increased， with more significant increase in model group; compared with model group， lipid deposition in medicinal cake-separated moxibustion group and atorvastatin group reduced significantly， and there was no significant difference between medicinal cake-separated moxibustion group and atorvastatin group. Conclusion By inhibting Wnt/β-catenin pathway， medicinal cake-separated moxibustion can down-regulate the content of SREBP1c and play the role of lipid regulation.

〔Keywords〕 medicinal cake-separated moxibustion; hyperlipidemia; blood lipid; Wnt1; β-catenin; dishevelled-1; sterol regulatory element-binding protein1c

高脂血癥是指體內脂質代謝紊亂，使體內一種或多種脂質水平高于正常，包括高總膽固醇（total cholesterol， TC）血癥、高甘油三酯（glycerin trilaurate， TG）血癥，伴或不伴高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol， HDL-C）降低和（或）低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol， LDL-C）升高[1-2]。高脂血癥是動脈粥樣硬化性心血管疾病（atherosclerotic cardiovascular disease， ASCVD）重要的危險因素，有效控制高脂血癥對防控ASCVD具有重要意義[1]。

肝臟是膽固醇與甘油三酯合成的重要場所，體內脂質代謝紊亂，膽固醇及TG在肝臟中大量積累，肝臟出現脂質沉積，進一步加速高脂血癥進程[2-3]。Wnt/β-卷曲蛋白（β-catenin）通過調控細胞增殖、分化和遺傳穩定性，以及維持成體前體細胞處于多能性狀態，控制生命早期的幾個發育過程和成熟組織的動態平衡，包括肝膽發育、成熟、分區[4-7]。現有研究表明，Wnt/β-catenin通路在肝臟發育、穩態及代謝過程中起關鍵作用，并且與高脂血癥的發生發展有密切關系，參與膽固醇合成、肝臟脂肪生成與累積等高脂血癥形成的多個環節[5-6，8-10]，是參與高脂血癥進程的重要機制之一[10-11]。課題組前期研究表明，隔藥餅灸具有良好的調脂作用[12-15]。故本實驗在前期研究結果上，以高脂血癥兔為研究對象，以隔藥餅灸為干預方式，探討隔藥餅灸能否通過調控Wnt/β-catenin通路，從而調節高脂血癥的進程。

1 材料與方法

1.1? 實驗動物與分組

雄性3月齡新西蘭純種兔48只，體質量1.5～2.5 kg，實驗動物生產許可證編號：SCXK（湘）2020-0005，由湖南中醫藥大學動物實驗中心提供，每只分籠圈養于動物中心實驗室（清潔級）。飼養溫度20～25 ℃，濕度50%～70%，自由進食及飲水。 適應性喂養1周以后，將48只新西蘭兔進行分組，采用隨機數字表法分為正常組、模型組、隔藥餅灸組和阿托伐他汀組，每組12只。實驗過程中對動物的各種處理均遵照《關于善待動物的指導性意見》的有關規定。

1.2? 主要儀器與試劑

1.2.1? 主要儀器? 高速低溫離心機（型號：D3024R，美國SCILOGBX公司）;低速離心機（型號：S1010E，美國SCILOGBX公司）;GloMax酶標儀（型號：GM3030，美國Promega公司）;pH計（型號：PHS-3G，上海儀電科學儀器有限公司）;電子天平（型號：HLD-10002，杭州友恒稱重設備有限公司）;電熱恒溫槽（型號：DK-8D，上海精宏實驗設備公司）;基因擴增儀（型號：ETC811，蘇州東勝興業科學儀器有限公司）;超微量分光光度計（型號：NanoVue Plus，美國NannoVue公司）;移液槍（型號：10～1000 μL，德國Eppendorf公司）;超凈工作臺（型號：SW-CJ-1FD，蘇州凈化設備廠）;全自動生化儀（型號：Chemray 120，深圳雷杜生命科學股份有限公司）。

1.2.2? 主要試劑與藥物? 聚氰基丙烯酸正丁酯（butyleyanoacrylate， BCA）試劑盒（貨號：QB214754，美國Thermo Scientific公司）;RIPA裂解液（貨號：R0010，北京索萊寶科技有限公司）;30%丙烯酰胺（貨號：BL513B，Biosharp公司）;十二烷基硫酸（貨號：S8010，北京索萊寶科技有限公司）;甘氨酸（貨號：G8200，北京索萊寶科技有限公司）;磷酸酶抑制劑（貨號：04906837001，瑞士Roche公司）;甲醇（貨號：XK13-011，國藥集團）;乙醇（貨號：10009218，國藥集團）;RNA提取試劑盒（貨號：RN03，艾德萊生物技術有限公司）;逆轉錄試劑盒（貨號：FSQ-101，日本TOYOBO公司）;DNA聚合酶（貨號：AP231， TransStart）。

1.3? 模型制備

參照文獻[15]復制高脂血癥模型，高脂飼料具體配方為：1%膽固醇、10%蛋黃粉、5%豬油、84%基礎飼料。每兔總食量為120 g，單籠飼養。模型組、隔藥餅灸組、阿托伐他汀組為模型制備組。8周后，兔耳中動脈取血，當模型制備組TC值高于正常組TC值3倍以上，且TG和LDL-C與正常組比較升高（P<0.05），則判斷模型成立[15]。

1.4? 治療方法

造模結束后，正常組新西蘭兔繼續予以正常飲食喂養，模型組、隔藥餅灸組、阿托伐他汀組繼續予以高脂飲食喂養。隔藥餅灸組給予隔藥餅灸干預，阿托伐他汀組予以阿托伐他汀鈣片干預，均每天1次，1周干預6天休息1天，連續干預8周。

1.4.1? 隔藥餅灸組? 模型制備完成后，固定新西蘭兔于兔臺，量取穴位后，使用寵物電推剪將穴位處毛發剔除，將中藥大黃、澤瀉、山楂、丹參、郁金各等分粉碎為沫，并以醋調勻，制成直徑為1 cm、厚度為3 mm的降脂藥餅，放于穴位處，將艾炷放在藥餅上施灸，燃完后易壯再灸，每穴4壯，每天1次，Ⅰ組、Ⅱ組穴位交替施灸，持續時間為8周。參考余曙光、徐斌主編的《實驗針灸學》（人民衛生出版社，2016年第2版）及擬人比照法制定進行新西蘭兔穴位定位，Ⅰ組穴位為巨闕、天樞、豐隆，Ⅱ組穴位為心俞、肝俞、脾俞。

1.4.2? 阿托伐他汀組? 模型制備完成后，將阿托伐他汀鈣片磨成細粉（1.96 mg·kg-1·d-1），拌入阿托伐他汀組第一口飼料，待其食完后再補充普通飼料，連續喂養8周。

1.4.3? 其他? 正常組、模型組、阿托伐他汀組在同等條件下捆綁固定，但不予隔藥餅灸治療。

1.5? 實驗指標及檢測方法

1.5.1? 血脂檢測? 造模結束后行耳中動脈采血，治療結束后行腹主動脈采血，普通采血管靜置2 h后3000 r/min（半徑4 cm）離心15 min，按試劑盒說明書檢測兔血清TC、LDL-C、TG含量。使用Rayto-Chemray120全自動生化儀檢測兔血清血脂含量，并在檢測前進行儀器調試、參數設置、定標、質控等操作。

1.5.2? RT-PCR法檢測肝組織Wnt1、β-catenin、散亂蛋白-1（dishevelled-1， dvl-1）、固醇調節元件結合蛋白1c（sterol regulatory element-binding protein1c， SREBP1c）的mRNA表達量? 治療結束后，所有新西蘭兔均進行麻醉，取肝組織約100 mg，加液氮研磨;用1 mL Trizol室溫裂解5 min，4 ℃、1 2000 r/min（半徑8 cm）離心10 min;取上清液，每1 mL裂解液加0.2 mL氯仿，震蕩15 s，室溫孵育3 min，于4 ℃、1 2000 r/min（半徑8 cm）離心10 min，樣品分3層，取最上層，記錄水相體積;加水相體積一半的乙醇，混勻轉移到吸附柱，1 2000 r/min（半徑8 cm）離心45 s;加500 μL去蛋白液1 2000 r/min（半徑8 cm）離心45 s，加500 μL漂洗液洗兩次，1 2000 r/min（半徑8 cm）離心45 s;用100 μL水洗脫RNA，微量酶標儀測定RNA濃度，進行RNA逆轉錄，RT-PCR上機檢測。β-actin為內參基因，參考Genbank核苷酸序列資料，mRNA檢測的探針情況見表1。

1.5.3? 油紅O染色觀察肝組織脂質沉積? （1）切片：4 ℃解凍樣本，用手術刀修剪目標組織，切片用包埋劑包埋，將包埋臺固定在切片機上，先對組織表面進行粗切，待組織面修切平整后開始切片，切片厚度5～8 μm，在切取的組織切片上放置一塊干凈的載玻片。切片做好標記后，-20 ℃保存。（2）實驗步驟：冰凍切片干燥30 min后，用4%中性甲醛固定液在4 ℃條件下固定10 min。蒸餾水沖洗，60%異丙醇浸泡，用油紅O染色10 min（加蓋避光）。60%異丙醇將間質分化清晰，蒸餾水洗滌。蘇木精染色3～5 min，用蒸餾水沖洗3 min，用甘油明膠密封，最后使用顯微鏡觀察染色結果。

1.6? 統計學方法

所有數據均使用SPSS 21.0軟件進行統計學分析。計量資料符合正態分布者，以“x±s”表示，多組間比較采用One-Way ANOVA法，進行方差齊性檢驗，方差齊時兩兩比較選擇LSD法，方差不齊時選擇Games-Howell法。計量資料不滿足正態分布時，以“M（IQR）”表示，多組間選擇非參數秩和檢驗—K個獨立樣本Kruskal Wallis檢驗，組間差異有統計學意義時，行多重比較。均以P<0.05表示差異具有統計學意義。

RT-PCR圖片采用ImageJ軟件進行灰度分析，數據結果與相應的內參進行對比，通過均一化處理（每組數據都與相對應對照組相比）進行數據標準化;通路指標統計學方法為多組One-way ANOVA法。均以P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1? 一般情況

實驗期間，正常組精神狀態良好，動作靈敏，毛色光澤，大小便狀況無明顯變化;模型組體質量增長較快，動作遲緩，目光遲鈍，毛色黯淡。各治療組精神狀態尚可，反應一般。造模期間，正常組因腹瀉死亡1只，隔藥餅灸組因抽血骨折感染死亡1只，阿托伐他汀組因腹瀉死亡2只;干預期間，模型組因腹瀉、體表脂肪瘤潰破各死亡1只，隔藥餅灸組捆縛固定引發感染死亡2只。

2.2? 模型評價

造模8周后，與正常組比較，模型組、隔藥餅灸組、阿托伐他汀組血清TC、TG、LDL-C含量均明顯升高（P<0.001，P<0.01），TC含量高于正常組3倍以上，TG、LDL-C水平升高（P<0.01），提示模型制備成功。造模各組間差異無統計學意義（P>0.05）。詳見表2。

2.3? 各組兔血脂結果比較

與正常組比較，模型組TC、TG、LDL-C含量均明顯上升（P<0.001）;隔藥餅灸組、阿托伐他汀組TC、LDL-C含量均上升（P<0.01，P<0.001），TG含量變化差異無統計學意義（P>0.05）。與模型組相比，隔藥餅灸組、阿托伐他汀組TC、TG、LDL-C含量下降（P<0.05，P<0.01，P<0.001）。隔藥餅灸組與阿托伐他汀組血清TC、TG、LDL-C含量比較，差異無統計學意義（P>0.05）。詳見表3。

2.4? 各組兔肝組織Wnt1、β-catenin、dvl-1、SREBP1c的mRNA表達量比較

與正常組比較，模型組肝組織Wnt1、β-catenin、dvl-1、SREBPlc的mRNA表達量上升（P<0.001）;與模型組比較，隔藥餅灸組、阿托伐他汀組上述指標表達量明顯下降（P<0.01，P<0.001）;與隔藥餅灸組比較，阿托伐他汀組上述指標表達差異無統計學意義（P>0.05）。詳見表4、圖1。

2.5? 各組兔肝組織脂質沉積

脂質沉積結果如圖2所示，與正常組相比，模型組、隔藥餅灸組、阿托伐他汀組脂質沉積均有增加，模型組增加更明顯;與模型組相比，隔藥餅灸組、阿托伐他汀組脂質沉積明顯減少;隔藥餅灸組與阿托伐他汀組無明顯差異。

3 討論

中醫學并無“高脂血癥”的記載，將其歸屬于中醫“膏脂”“痰濁”“血濁”“脂濁”等范疇，并認為膏脂源于水谷，屬于津液，存于血中，與血互為化生[16-17]。高脂血癥的中醫發病機制主要為“本虛標實”，以氣、血、陰、陽虧虛為本，以痰濁、血瘀為標;其病理因素主要為痰、瘀、虛，致病臟腑主要涉及肝、脾、腎[18-20]。隔藥餅灸是一種將艾灸與藥物相結合的間接艾灸療法。艾灸具有溫通溫補的效應，通可通經活絡、活血化瘀、破血化痰，補可溫陽補虛、益氣固脫、升陽舉陷[21]。藥餅所選擇藥物為丹參、山楂、澤瀉、郁金、大黃，諸藥配伍可起到活血化瘀、化濁降脂之效。施灸穴位為心俞、巨闕、脾俞、肝俞、豐隆，俞募配穴與辨證選穴相結合，共奏活血祛瘀、健脾化痰之效。隔藥餅灸協同艾灸、藥物、穴位三者效應，針對高脂血癥的病因病機，發揮補虛、化痰、祛瘀的作用，補虛瀉實、標本兼治，從而發揮降血脂的效應。

血脂實驗結果顯示，經隔藥餅灸干預后，與模型組相比，隔藥餅灸組TC、TG、LDL-C均有明顯下降，說明隔藥餅灸能明顯改善高脂血癥兔的血脂水平;與阿托伐他汀組相比，隔藥餅灸組的血脂水平差異無統計學意義，說明隔藥餅灸的降脂效應與阿托伐他汀相當，但同正常組相比，血脂水平仍均有差異，其結果可能與實驗造模后血脂水平上升程度大，隔藥餅灸干預時間有限，尚未達到降脂的最佳效應有關。

Wnt信號通路參與脂質生成的過程，并與高脂血癥有緊密聯系[22-23]。Wnt1蛋白是Wnt/β-catenin通路的重要活化蛋白，與卷曲蛋白及相關受體蛋白結合成復合體，通過激活dvl-1，抑制破壞復合物的磷酸化，減少其對β-catenin的磷酸化及降解，使β-catenin含量增加，與相關受體結合，從而激活Wnt/β-catenin信號通路[24-25]。β-catenin是經典Wnt通路中的核心因子，介導Wnt信號從細胞膜至細胞質進核的傳遞[26]，dvl-1的主要作用是抑制β-catenin的降解，從而促進Wnt信號通路的激活，它可能存在細胞核內、細胞質或者細胞膜上，是Wnt信號通路的一個重要環節[6，23]。

有研究表明，Wnt/β-catenin 通過特異性蛋白1（specificity protein 1， Sp1）-胰島素樣生長因子1（insulin-like growth factor 1， IGF1）通路，調節哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin， mTOR）通路的營養-敏感機械目標，導致SREBP1c表達增加，從而使脂肪生成途徑增強[25-28]。SREBP1c是脂質代謝的重要調控因子，對于維持脂代謝穩態有重要意義，尤其在肝臟和脂肪組織中，它能調控脂肪酸、TG和TC的合成，參與LDL-C代謝相關基因表達，上調脂肪合成基因表達，可明顯增加游離脂肪酸、TC及LDL的合成[29-32]。據報道，轉人源nSREBP1c轉基因小鼠的肝重及TG含量均顯著升高[6，31]。

Wnt/β-catenin信號通路及相關指標結果顯示，與正常組相比，模型組Wnt1、β-catenin、dvl-1、SREBP1c 的mRNA表達明顯升高。與模型組相比，隔藥餅灸組、阿托伐他汀組Wnt1、β-catenin、dvl-1、SREBP1c 的mRNA表達明顯下降。經高脂飲食造模后，高脂血癥模型肝組織Wnt1 mRNA表達升高，從而激活下游的dvl蛋白，減少β-catenin的磷酸化，使β-catenin表達增加，此時Wnt/β-catenin信號通路處于激活狀態，上調其下游SREBP1c蛋白的表達，使脂肪生成途徑增強，血脂水平上升[22-23，33-34]，故Wnt/β-catenin通路在脂肪細胞生成中具有重要作用[35-36]。治療后Wnt/β-catenin信號通路處于抑制狀態，SREBP1c蛋白表達降低，肝組織脂質沉積減少，從而起到調脂作用[35，37-38]。阿托伐他汀鈣片可以通過抑制Wnt/β-catenin信號通路，從而改善大鼠非酒精性脂肪性肝病的肝臟損傷程度[38]。人參皂苷Rg1也可通過抑制Wnt/β-catenin信號通路，抑制高脂膳食誘導的小鼠非酒精性脂肪性肝病肝纖維化的進程[28]。本研究顯示，隔藥餅灸組Wnt1、β-catenin、dvl-1、SREBP1c的mRNA表達量與阿托伐他汀組相比差異無統計學意義，說明隔藥餅灸與阿托伐他汀鈣片對Wnt/β-catenin信號通路的抑制作用大致相同，這也許是二者發揮調脂作用的共同機制之一。本研究初步檢測了Wnt1、β-catenin、dvl-1、SREBP1c的mRNA表達量，將在接下來的實驗研究進行蛋白含量檢測，為研究隔藥餅灸對Wnt/β-catenin信號通路的影響提供更強有力的證據。

綜上所述，隔藥餅灸與阿托伐他汀鈣片可能通過抑制Wnt/β-catenin信號通路，下調SREBP1c的mRNA表達，減少脂質合成，發揮調脂作用。包括阿托伐他汀鈣片在內的他汀類藥物是目前使用范圍最為廣泛的降脂藥物，其降脂效果明顯，但是他汀類降血脂藥物有橫紋肌溶解、血轉氨酶和肌酸激酶水平升高、胃腸道癥狀等毒副作用[39]。隔藥餅灸是結合艾灸效應、中藥功能、穴位作用的一種安全有效、簡單易行的中醫外治法，其降脂效應與阿托伐他汀鈣片相當，操作簡便且毒副作用少，值得臨床應用與推廣。

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